STED顯微鏡研制可望一石二鳥

在受激發(fā)射損耗(STED)顯微鏡的開發(fā)過程中，持續(xù)性的進展雖然表現(xiàn)得很慢，但確信可以滿足具有超高分辨率的熒光顯微鏡在方法學上的需求，而且也許會給其它的成像模式帶來一些意想不到的好處。

早在1994年，Stefan Hell首先提出了受激發(fā)射損耗(STED) 顯微鏡的概念，兩年后，這種顯微鏡就展現(xiàn)在人們面前。自從那時以來，他領導的研究小組就對這一技術進行了持續(xù)的改進，結果這一技術在近期一些奇妙的生物學發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。拋開這一進展不談，這一實驗方法并沒有被外界廣泛使用，其原因是由于在建設STED顯微鏡時需要可調(diào)式脈沖激光，而且我們還會想起雙光子顯微鏡當時所要面對的情形：在早期階段，人們并不是十分清楚它帶來的益處是否會超過它的花費。

Hell及其同事近來有兩篇論文出版，一是發(fā)表在《美國科學院院刊》，一是發(fā)表在本期的《自然-方法學》上。這兩篇論文介紹了在STED顯微鏡技術的開發(fā)和應用過程中所取得的持續(xù)進展。發(fā)表在《自然-方法學》上的報告，首次闡釋了STED顯微鏡能夠用于熒光蛋白質(zhì)，這是利用STED顯微鏡實現(xiàn)活細胞成像過程中的重要一步。

發(fā)表在《美國科學院院刊》上那篇報告所介紹的進展，具有更為重要的潛在意義。Donnert等人報告了一個驚奇發(fā)現(xiàn)--將STED所使用到的配對照明脈沖之間的間隙寬度進行擴展時，導致了更低的光致褪色效應和更高的熒光發(fā)射現(xiàn)象。

光致褪色效應總能在STED顯微鏡中觀察到，因為這一技術使用了一種很高的發(fā)光強度，大約是典型的單光子熒光顯微鏡的10-100倍，雖然染色劑并不希望能吸收這一波長。即使這一強度不到多光子成像激發(fā)強度的百分之一，甚至千分之一，STED顯微鏡使用了與單光子成像技術中一樣的可見光譜區(qū)和脈沖中相似數(shù)量的光子。

漂白的發(fā)生通常源于熒光團轉(zhuǎn)移到一種被稱為“三線態(tài)”的受激能量狀態(tài)。這是一種長期活躍的狀態(tài)，能在更寬的波長范圍內(nèi)吸收光子，非常有利于漂白發(fā)生�！昂茱@然，在三線態(tài)和高強STED脈沖之間一定有著某種聯(lián)系，” Hell說�！拔覀兇_信，我們能通過這樣的一種方式改變設置，使得重復率變得更低�！泵}沖之間存在的更長時間，應當為三線態(tài)中的任何分子提供時間，以便轉(zhuǎn)換回基準態(tài)。他們稱這種照明方法為三線放松型(T-Rex)STED。

不僅僅減少重復率導致了漂白效率的降低，而且它還導致熒光信號強度產(chǎn)生了實質(zhì)性的增加。Hell說，“信號增強得如此之大，以致于錄音時間的有效加長僅僅通過4-10這一因子增加，”不管在實際的照明時間中有30-80倍的減少。這一簡單的變化使得它們能夠應用一種十倍光強的STED光束。根據(jù)管理STED顯微鏡分辨率的平方根法則，這一十倍光強導致了另一三倍分辨率的增加，降低到20nm，也就是低于衍射柵欄的某一尺度。

雖然降低重復率導致了發(fā)射強度的極大增強，Hell及時補充說，“這不是我愿意推薦的最終解決方案。真正的方案是快速掃描。如果你掃描得很快，致使僅僅一兩個脈沖撞擊相同的分子，接著光束會消失，那么你就取得了相同的效果，但你保持住了來自樣品的熒光流�！辈恍业氖牵�在STED顯微鏡中要實施快速的掃描在技術上還不太可能。

STED顯微鏡能否成為一種重要的成像模式，以便能為熒光成像提供超高的分辨率？上述進展為此提供了美好的前景。下一個大的進展很可能就是光束掃描。這不僅僅能進行活細胞成像，而且還能提供一個實施T-Rex STED的理想方式。

有意思的是，為何T-Rex的益處不應當推廣到那些像雙光子顯微鏡使用脈沖激光的任何成像模式呢？這并沒有任何理論上的原因。也許可以發(fā)現(xiàn)，脈沖激光應用于T-Rex以獲得傳統(tǒng)的單光子成像可能也有一些優(yōu)點。在改進STED顯微鏡技術的過程中，如果最終的革新之一是以對熒光顯微鏡產(chǎn)生普遍性的顯著影響為結果，那將是很滑稽的。

注：夏雨譯自2006年9月號的《自然-方法學》，版權為英國NPG出版集團所有。