讓膜蛋白結(jié)晶觸手可及

    完整的膜蛋白如G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和離子通道，是參與細(xì)胞信號通路、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和人類疾病的關(guān)鍵分子；大約三分之一已批準(zhǔn)的藥物靶定了這些蛋白。因此，獲得膜蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，以便與分子和細(xì)胞數(shù)據(jù)互補(bǔ)，對科學(xué)界和藥物開發(fā)行業(yè)相當(dāng)重要。

    眾所周知，膜蛋白很難純化和結(jié)晶，因?yàn)樗鼈冊谔烊恢�雙層之外的環(huán)境中不穩(wěn)定，容易沉淀。正因?yàn)槿绱耍�使用水溶液的結(jié)晶學(xué)傳統(tǒng)方法不適合它們的重新溶解。在1996年，科研人員開發(fā)出一種in meso脂立方相（LCP）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌視紫紅質(zhì)的結(jié)晶¹，從那以后也徹底改變了膜蛋白的結(jié)晶過程。這種方法為膜蛋白的成核和生長提供了一個(gè)框架，從而促進(jìn)了結(jié)晶。

    LCP結(jié)晶是通過兩個(gè)步驟開展的。首先，蛋白與脂類混合，自發(fā)形成脂立方相，產(chǎn)生了果凍狀的高粘稠物質(zhì)。為了加強(qiáng)結(jié)晶，還添加了添加劑和沉淀物，取決于不同條件，結(jié)晶一般在數(shù)日或數(shù)周出現(xiàn)。

    結(jié)晶試驗(yàn)通常包括在樣品上試驗(yàn)的大量條件。高效的結(jié)晶試驗(yàn)不僅需要盡可能降低樣品體積，以確保寶貴蛋白的最大限度利用，還需要自動(dòng)化開展，以便減少艱苦的體力勞動(dòng)并加速平板制備過程。自動(dòng)化減少了手動(dòng)移液的誤差，并確保了樣品均一性。
 
    目前與LCP方法相關(guān)的多個(gè)技術(shù)問題為此過程的自動(dòng)化帶來了挑戰(zhàn)。然而，主要問題在于很難準(zhǔn)確處理小體積且極為粘稠的立方相材料，直到最近，這一問題才成功解決。

脂類/蛋白相的混合和處理
  
    蛋白和脂類的混合問題是由Martin Caffrey成功解決的，這位科學(xué)家目前在都柏林的圣三一學(xué)院，他開發(fā)出一種方法來連接兩個(gè)注射器，一個(gè)含有脂類，而另一個(gè)含有蛋白，這兩個(gè)注射器由體積連接器相連。注射器之間蛋白和脂類的來回反復(fù)混合使得脂立方中間相形成2。

   mosquito® LCP移液設(shè)備旨在將LCP材料和篩選緩沖液的納升級分液過程自動(dòng)化。它是通過TTP LabTech、Gebhard Schertler和Pat Edwards之間的合作項(xiàng)目而開發(fā)的。

    通過一個(gè)可選的LCP混合器，mosquito® LCP為in meso（LCP）技術(shù)提供了一個(gè)全自動(dòng)的方案，從而顯著提高了設(shè)置篩選平板的速度。準(zhǔn)確分配納升級LCP溶液的能力，其體積比手動(dòng)方法要小得多，節(jié)省了寶貴的樣品，實(shí)現(xiàn)了更多篩選條件的評估。

LCP分液準(zhǔn)確性和重復(fù)性

    mosquito® LCP的可靠性是基于其注射器分液臂和mosquito移液器吸頭準(zhǔn)確分配LCP液滴和篩選溶液的能力，確保了液滴體積和位置的一致，從而避免了手動(dòng)誤差。

    mosquito® LCP融合了已被廣泛接受的mosquito® Crystal的特征和功能，將mosquito移液頭與微注射器分液器相結(jié)合，能將25-2000 nl的LCP材料準(zhǔn)確分配至載玻片或市售的平板上。mosquito® LCP與所有SBS形式的平板兼容，包括最近由Schertler小組和SWISSCI開發(fā)的LCP平板，它能實(shí)現(xiàn)晶體的高效成像。

   mosquito® LCP分配體積的分析證明了它的高準(zhǔn)確性，對于低至25 nl的體積，誤差小于10%。圖1表明，對于所有檢測的體積，液滴體積的變異系數(shù)（CV）百分比小于10%，且隨體積增加而逐漸降低。

    每孔中液滴的精確和重復(fù)定位（在5 μm之內(nèi)）確保了LCP液滴頂部的準(zhǔn)確緩沖液覆蓋以及膜蛋白晶體的高效成像（圖2）。一旦分配了LCP液滴（圖2a），會(huì)迅速地將沉淀劑直接加在這些液滴上，讓它們暴露在空氣和環(huán)境影響中的時(shí)間縮短至2秒以內(nèi)（圖2b）。

圖1 | mosquito® LCP注射器的分液準(zhǔn)確性變化小于10%。在膜蛋白結(jié)晶常用的100 μl體積，其準(zhǔn)確性提高至6%。

圖2 | 利用TTP LabTech的mosquito® LCP精確且重復(fù)地放置每孔中的液滴。(a) 正向置換注射器泵將50 nl LCP液滴分配至96孔板中，且在5 μm之內(nèi)。(b) 利用mosquito一次性吸頭將納升級的沉淀劑以列形式快速分配至LCP液滴上，從而減少了LCP液滴在空氣和環(huán)境影響中的暴露。

沉淀和結(jié)晶

    在優(yōu)化結(jié)晶過程的篩選階段，一個(gè)準(zhǔn)確的自動(dòng)化移液系統(tǒng)的真正好處變得明顯。在此階段要研究各種添加劑（如去垢劑、有機(jī)物、鹽）和市售的沉淀劑，以確定晶體形成的最佳條件。

    mosquito Crystal、mosquito® LCP臂和移液頭的組合實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)的LCP液滴、添加劑和沉淀劑分配，讓96孔板的設(shè)置可在5分鐘內(nèi)完成，且獨(dú)特的正向置換吸頭允許多次吸取和沉淀劑添加。一次性吸頭保證了零交叉污染，避免了耗時(shí)的吸頭洗滌。

    讓整個(gè)過程自動(dòng)化不僅節(jié)省了時(shí)間和精力，也確保了分配的液體體積和液滴位置的重復(fù)性，這對膜蛋白的高效結(jié)晶很關(guān)鍵。圖3顯示了最近利用TTP LabTech的mosquito® LCP對β-腎上腺素受體的成功結(jié)晶，從而實(shí)現(xiàn)了這種膜蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)確定。

圖3 | 利用TTP LabTech的mosquito® LCP對β-腎上腺素受體的結(jié)晶。(a) LCP設(shè)置中的β-腎上腺素受體是在LCP夾心板中以280 nm波長的光成像的。(b) LCP晶體中的β-腎上腺素受體層與膜平面大致垂直。（圖片是由T. Warne、P. Edwards和G. Schertler提供的。）

    就所有蛋白的結(jié)晶學(xué)而言，環(huán)境（溫度和濕度）對潔凈過程的影響至關(guān)重要。對于高度敏感的膜蛋白更是如此。TTP LabTech的mosquito® LCP儀器的小巧和穩(wěn)定不僅確保了它的占地面積很少，還讓科學(xué)家能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)移至環(huán)境可控的空間，便于膜蛋白的成功結(jié)晶。

1. Landau, E.M. & Rosenbusch, J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14532–14535 (1996).生物通 www.ebiotrade.com
2. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H. & Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids 95, 11–21 (1998).