NK細(xì)胞培養(yǎng)存在的問(wèn)題與解決方法

NK細(xì)胞，您培養(yǎng)的怎么樣
 

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、 抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。

目前，NK細(xì)胞培養(yǎng)存在兩種培養(yǎng)方式：

1、滋養(yǎng)層細(xì)胞（人腫瘤細(xì)胞，即人白血病K562細(xì)胞）培養(yǎng)方式。
首先獲得具有不分裂不增殖但仍保持代謝活性的滋養(yǎng)層細(xì)胞。該細(xì)胞通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行改造，再經(jīng)過(guò)鈷60輻照，細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)多種細(xì)胞因子，在多種細(xì)胞因子協(xié)同作用下，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞得到定向激活和擴(kuò)增。

該種培養(yǎng)方式的價(jià)格相對(duì)便宜，僅有3000元左右。從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，細(xì)胞收獲量可達(dá)到20億/L的水平，NK表型陽(yáng)性率達(dá)到80%-90%左右。

2、純因子細(xì)胞培養(yǎng)方式。
顧名思義就是使用相應(yīng)的細(xì)胞因子來(lái)刺激單個(gè)核細(xì)胞，向NK細(xì)胞方向誘導(dǎo)，并配合相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，使NK細(xì)胞大量增殖。純因子細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以其安全性高而著稱(chēng)，其原因在于所使用的細(xì)胞因子，都是體內(nèi)環(huán)境原本就存在的。培養(yǎng)過(guò)程相當(dāng)于模擬體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)NK細(xì)胞的激活及大量增殖。

從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，細(xì)胞收獲量可達(dá)到15-25億/L的水平，NK表型CD3-CD56+達(dá)到40%-90%左右。日本在該項(xiàng)技術(shù)上走在國(guó)際前列。由于日本老齡化嚴(yán)重，因此抗衰老研究較多。NK細(xì)胞在抗衰老研究中的應(yīng)用符合其嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)管理原則。因此國(guó)內(nèi)使用的純因子試劑盒多進(jìn)口自日本。但由于技術(shù)壁壘，純因子試劑盒的價(jià)格一直居高不下，多在6000元以上。

但從培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方式性?xún)r(jià)比更高，但由于在培養(yǎng)過(guò)程中選用的滋養(yǎng)層細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，用戶(hù)對(duì)此種培養(yǎng)方式實(shí)際是心存排斥的。盡管從理論上講，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)不再具備增殖的可能性，但其潛在風(fēng)險(xiǎn)難以證明可以完全排除。另外，就是倫理方面的問(wèn)題，將正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)后的NK細(xì)胞回輸體內(nèi)，確實(shí)存在難以克服的倫理障礙。正如上述原因，確實(shí)制約了滋養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)的推廣。
2016年，某國(guó)產(chǎn)品牌在生物谷細(xì)胞治療會(huì)議中推出國(guó)內(nèi)首款NK純因子培養(yǎng)產(chǎn)品，兩年間，300多家用戶(hù)對(duì)該產(chǎn)品的評(píng)價(jià)差異極大：大部分覺(jué)得很好，可以得到滿(mǎn)意的結(jié)果；一部分覺(jué)得不太好，因?yàn)椴皇撬�有樣本的培養(yǎng)結(jié)果都讓人滿(mǎn)意，總是有某些樣本的細(xì)胞數(shù)量少或者NK表型低。

經(jīng)與用戶(hù)深入溝通，友康生物發(fā)現(xiàn)結(jié)果不理想的主要原因是某些樣本在培養(yǎng)的前半程（7天之前）密度上升緩慢，用戶(hù)難以貫徹廠家的補(bǔ)液原則。培養(yǎng)液不是補(bǔ)多了就是補(bǔ)得少，那結(jié)果會(huì)怎樣呢？

1、培養(yǎng)液補(bǔ)得多。培養(yǎng)液補(bǔ)多了，則NK細(xì)胞的密度更低，細(xì)胞生長(zhǎng)更加緩慢，導(dǎo)致在2天后新的補(bǔ)液時(shí)點(diǎn)到來(lái)時(shí)，密度更加達(dá)不到補(bǔ)液要求。

2、培養(yǎng)液補(bǔ)得少。補(bǔ)液補(bǔ)少了，NK細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物無(wú)法充分稀釋?zhuān)�整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境變得有毒害，導(dǎo)致NK細(xì)胞密度更加難以上升。這類(lèi)樣本，有的用戶(hù)2L培養(yǎng)體系僅能收到10億-20億的細(xì)胞數(shù)量。僅為正常值的15%-30%，給用戶(hù)造成了極大的困擾。

這種現(xiàn)象，在廠家看來(lái)是有些客戶(hù)尚未能完全掌握NK細(xì)胞的培養(yǎng)技巧導(dǎo)致。但站在用戶(hù)的角度來(lái)說(shuō)，如果廠家在產(chǎn)品設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)能夠做到不需要用戶(hù)面對(duì)NK細(xì)胞前期生長(zhǎng)緩慢的情況，是不是就可以大幅減少甚至完全避免用戶(hù)的操作錯(cuò)誤呢？是不是就可以大幅提升用戶(hù)自己的培養(yǎng)結(jié)果嗎？

結(jié)果是肯定的。于是友康生物根據(jù)客戶(hù)的反饋，重新設(shè)計(jì)了NK前期培養(yǎng)中的激活、擴(kuò)增等環(huán)節(jié)的技術(shù)處理，推出2018版NK純因子培養(yǎng)產(chǎn)品。即便是狀態(tài)比較差的樣本，也可以在培養(yǎng)前期（7天之前）達(dá)到一個(gè)較高的生長(zhǎng)密度，跳過(guò)了需要極其豐富經(jīng)驗(yàn)才可正確應(yīng)對(duì)的在細(xì)胞密度過(guò)低時(shí)的補(bǔ)液要求。

此次產(chǎn)品升級(jí)的不是該產(chǎn)品的理論性能，即廠家的技術(shù)人員或經(jīng)驗(yàn)豐富的客戶(hù)技術(shù)人員可以達(dá)到的培養(yǎng)結(jié)果；而是該產(chǎn)品的實(shí)際性能——客戶(hù)的經(jīng)驗(yàn)不太豐富的技術(shù)人員可以達(dá)到的培養(yǎng)結(jié)果�？蛻�(hù)的技術(shù)人員僅僅需要按照廠家給出的補(bǔ)液原則常規(guī)補(bǔ)液即可，不會(huì)再遇到前7天細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)不到理論密度的情況。極大降低了NK培養(yǎng)難度，大幅提升了該產(chǎn)品在客戶(hù)處的培養(yǎng)結(jié)果：50ml外周血或50ml臍帶血，均可達(dá)到40-60億/2L的細(xì)胞總數(shù)，60-90%的CD3-CD56+陽(yáng)性率的培養(yǎng)結(jié)果。

外周血NK細(xì)胞倍增曲線：
細(xì)胞總數(shù)44.2億/2L 體系；CD3-CD56+：72.0%


臍帶血NK細(xì)胞倍增曲線：
細(xì)胞總數(shù)40.8億/2L 體系；CD3-CD56+：63.1%


另外，針對(duì)客戶(hù)提出的培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)袋的組合困惑問(wèn)題，友康生物在機(jī)理方面進(jìn)一步明晰了NK細(xì)胞培養(yǎng)全程中培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)袋之間接力培養(yǎng)的工藝細(xì)節(jié)與陷阱，給出了明確無(wú)誤、結(jié)果可信的操作指導(dǎo)，將指導(dǎo)用戶(hù)避開(kāi)培養(yǎng)失敗陷阱，可大幅提供用戶(hù)的培養(yǎng)成功率，為用戶(hù)的業(yè)務(wù)拓展奠定堅(jiān)實(shí)的產(chǎn)品基礎(chǔ)。

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