實例講解：外周單個核細(xì)胞（PBMC）的計數(shù)方法

瀏覽次數(shù)：18839　發(fā)布日期：2021-6-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

關(guān)于外周血單個核細(xì)胞（PBMC）

從供體中收集全血，分離并保存PBMC，同時保留剩余的血細(xì)胞和成分返回到主體（單采血液成分法）¹。該過程產(chǎn)生大量的PBMC，其適合于進(jìn)一步的實驗或研究。

PBMC的計數(shù)
PMBC的大小小于許多哺乳動物細(xì)胞類型，并且取決于樣本，可能包含紅細(xì)胞（紅細(xì)胞，RBC）污染。建議在通過康寧細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)之前，通過離心分離或裂解去除RBC。
PMBC通常使用費時的手動方法（例如血球計數(shù)器）進(jìn)行計數(shù)。自18世紀(jì)2以來，血細(xì)胞計數(shù)儀一直被認(rèn)為是進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果通常是主觀的，易變的，并且細(xì)胞直徑的細(xì)微差異無法輕易或可重復(fù)地產(chǎn)生被察覺。

康寧細(xì)胞計數(shù)器提供了另一種方法，可以快速，準(zhǔn)確地對這些細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。開發(fā)了計數(shù)算法以識別和清除碎片并解決死細(xì)胞的問題，同時該應(yīng)用程序的功能允許對種群進(jìn)行門控，以從最終計數(shù)中清除較大的細(xì)胞和碎片。

材料和方法
使用康寧細(xì)胞計數(shù)器和使用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行手動計數(shù)在兩個不同的天對來自兩個供體（所有細(xì)胞；阿拉米達(dá)，加利福尼亞）的冷凍保存的PBMC（無RBC）進(jìn)行計數(shù)。
在康寧細(xì)胞計數(shù)器上對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后立即進(jìn)行手動計數(shù)，并使用血細(xì)胞計數(shù)器和錐蟲藍(lán)排除法確定細(xì)胞活力。計數(shù)區(qū)域（1.96毫米2）的代表性圖像如（圖1）所示。

使用了康寧單元計數(shù)器的多計數(shù)功能（作為一個計數(shù)的一部分，最多可以采樣八個字段）。在這個實驗中，使用康寧細(xì)胞計數(shù)器對每個計數(shù)采樣了八個不同的區(qū)域（總面積= 15.68 mm2），而手動方法對血細(xì)胞計數(shù)器的五個大正方形進(jìn)行了計數(shù)（總面積= 5 mm2）。

圖1.調(diào)焦后和計數(shù)后的代表性康寧細(xì)胞計數(shù)器圖像。

（A）計數(shù)前正確聚焦圖像。
（B）計數(shù)結(jié)果�；罴�(xì)胞（綠色圓圈）；死細(xì)胞（紅色圓圈）。通過算法和用戶指定細(xì)胞大小的門控，可以排除小細(xì)胞和碎片的計數(shù)（圖2中的示例）。
（C）面板（B）的放大圖。

圖2.

（A）直方圖顯示了澆口直徑設(shè)置為5至16 µm。超出此閾值的單元格從計數(shù)中排除�？梢郧袚Q死細(xì)胞（紅色條）和活細(xì)胞（綠色條）以獨立檢查那些亞群。顯示了一個樣品中八個計數(shù)的平均值±SD；如所述使用多計數(shù)功能。
（B）可通過使用多計數(shù)功能獲得擴(kuò)展的數(shù)據(jù)。

結(jié)果和討論

使用CytoSMART™應(yīng)用程序或CytoSMART云中結(jié)果頁面的直方圖功能，門控設(shè)置為5至16 µm（圖2）。對于此評估期間生成的實驗數(shù)據(jù)，（圖3）和（圖4）顯示了兩個供體在10個獨立樣本中的結(jié)果。

當(dāng)使用配對t檢驗比較兩種計數(shù)方法時，細(xì)胞密度和活力百分比的p值均大于0.05，表明每個數(shù)據(jù)集之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果表明康寧®細(xì)胞計數(shù)器適合由經(jīng)過培訓(xùn)的操作員對PMBC進(jìn)行精確計數(shù)。

對PBMC進(jìn)行計數(shù)時，重要的是避免計數(shù)不是細(xì)胞的死細(xì)胞。要在康寧細(xì)胞計數(shù)儀上計數(shù)為死細(xì)胞，該細(xì)胞在所有字段中必須顯示為暗色，如（圖5）所示。另外，還要注意計數(shù)的樣品中不存在RBC，因為這可能會降低計數(shù)的準(zhǔn)確性。

圖3.通過計數(shù)方法得出的細(xì)胞密度（圖表以供體分隔）。聯(lián)合供體的配對t檢驗p = 0.141。

圖4.通過計數(shù)方法得出的細(xì)胞活力（圖表以供體分隔）。聯(lián)合供體的配對t檢驗p = 0.718。

圖5.活細(xì)胞與死細(xì)胞聚焦圖像

結(jié)論
康寧細(xì)胞計數(shù)器可用于需要精確細(xì)胞計數(shù)的PBMC計數(shù)中，并用作血細(xì)胞計數(shù)器手動計數(shù)的替代方法。
盡管康寧細(xì)胞計數(shù)器非常易于使用，但需要觀察到適當(dāng)?shù)木劢辜夹g(shù)，以避免來自不同用戶的計數(shù)的主觀性。每一次計算，用戶都將獲得經(jīng)驗和熟練程度，從而提高準(zhǔn)確性。

與通過手動方式相比，可以在康寧細(xì)胞計數(shù)器上對密度更高的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計數(shù)。因此，將更準(zhǔn)確地表示整個細(xì)胞群體，并且完全避免了“咔噠聲疲勞”的相關(guān)問題。
與手動計數(shù)相比，使用多計數(shù)功能是對較大區(qū)域進(jìn)行計數(shù)的一種快速簡便的技術(shù)。

康寧細(xì)胞計數(shù)儀
Corning細(xì)胞計數(shù)儀可在三秒內(nèi)完成單次細(xì)胞計數(shù)*，相較大多數(shù)的自動細(xì)胞計數(shù)儀更快。傳統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)是基于圖像分析算法在一個相對較小的計算平臺上完成。而 Corning細(xì)胞計數(shù)儀則采用CytoSMART™云計算應(yīng)用軟件，通過MicrosoftAzure云端計算平臺進(jìn)行圖像處理。這種云計算系統(tǒng)意味著更快更準(zhǔn)確的圖像分析能力。

準(zhǔn)確率高
Corning細(xì)胞計數(shù)儀使用先進(jìn)的圖像分析處理軟件，應(yīng)用復(fù)雜的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，使細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性達(dá)到最大。若添加臺盼藍(lán)，儀器便可在計數(shù)時區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，從而計算出細(xì)胞活力。同時該軟件還能對含有細(xì)胞簇的樣本進(jìn)行分析處理，所以對高濃度的細(xì)胞樣本（高達(dá)1 x 10 7 個細(xì)胞/ mL）Corning細(xì)胞計數(shù)儀亦能進(jìn)行精確計數(shù)。

計數(shù)成本低
每臺Corning細(xì)胞計數(shù)儀會提供一片可重復(fù)使用的細(xì)胞計數(shù)板，很大程度的節(jié)約了客戶一次性耗材的投入成本。同時客戶也可使用相應(yīng)的血球計數(shù)板結(jié)合Corning細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

操作簡便
Corning細(xì)胞計數(shù)儀操作十分簡便，無需花費過多的時間進(jìn)行人員操作培訓(xùn)。首先，將儀器連接到您的計算機(jī)或平板電腦，啟動CytoSMART™云應(yīng)用程序。然后，將裝有樣本的細(xì)胞計數(shù)板放置在儀器上，調(diào)整焦距，點擊“計數(shù)”按鈕，即可進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，可對8次計數(shù)結(jié)果進(jìn)行同步分析。

隨時隨地查看數(shù)據(jù)
傳統(tǒng)自動細(xì)胞計數(shù)儀瓶頸：
◗ 機(jī)載的計算機(jī)系能較小，報告生成時間過長。
◗ 屏幕分辨率低，不能很好的分辨出活細(xì)胞或死細(xì)胞。
◗ 只能通過U盤將數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

Corning細(xì)胞計數(shù)儀很好的解決了以上難題。Corning細(xì)胞計數(shù)儀可在計算機(jī)上快速生成測試報告，包含計數(shù)樣本的細(xì)胞濃度和活力，以及標(biāo)注活細(xì)胞和死細(xì)胞的樣本圖像（若計數(shù)時添加臺盼藍(lán)），并將報告發(fā)送至CytoSMART™云端，使您可以隨時隨地在智能手機(jī)，平板電腦或計算機(jī)上查閱生成的圖像和計數(shù)結(jié)果。所有測試生成的報告都將保存在CytoSMART™云端，因此您可以調(diào)閱相聯(lián)實驗的報告分析細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)和質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)
1.https://www.allcells.com/tissue-products/leukopak/
2. Lin-Gibson S, et al. Summary of the National Institute of Standards and Technology and US Food and Drug Administration cell counting workshop: Sharing practices in cell counting measurements Cytotherapy, 2018; 20:785-795.

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網(wǎng)友評論 已有[1]人評論

匿名 (123.14.97.112)
conning細(xì)胞計數(shù)儀是在顯微鏡下顯示細(xì)胞，計數(shù)的是視野內(nèi)的細(xì)胞。顯微鏡下視野大小隨放大倍數(shù)和聚焦距離變化。計數(shù)區(qū)域面積1.96毫米2是怎么確定的？真實性，準(zhǔn)確度多大，有參照標(biāo)準(zhǔn)嗎？請通過郵箱回復(fù)。
2022-2-25 10:31:00

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