細(xì)胞凍存及復(fù)蘇操作步驟

細(xì)胞凍存：
1.  配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。
2.  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。
3.  離心1 000 rpm，5 min。
4.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5.  將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。
6.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。
7.  凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
      
細(xì)胞復(fù)蘇：
1.  從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
2.  從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3.  離心， 1 000 rpm，5 min。
4.  棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5.  次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。