人肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)方法與應(yīng)用

 　　　一、背景

　　人肝癌細(xì)胞來源于一名15歲的白人少年的肝癌組織。該細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、纖溶酶原、補(bǔ)體C4、C3激活物、纖維蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白；表達(dá)胰島素受體和胰島素樣生長因子IGFⅡ的受體；該細(xì)胞具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未證明該細(xì)胞中有HBV基因組。

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)方法

　　1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

　　①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

　�、诩尤�2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

　�、�1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

　�、軐⒓�(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

　�、萦眯迈r培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

　�、迲腋〖�(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

　　2、細(xì)胞復(fù)蘇：

　　①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

　�、谠�1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

　　3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

　�、贄壢ヅ囵B(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

　�、�1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

　�、蹖⒓�(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

　　④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

　　三、應(yīng)用

　　用于蜂毒素誘導(dǎo)保護(hù)性自噬對(duì)人肝癌細(xì)胞生長的影響研究：

　　以人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HepG2為研究對(duì)象,并建立了肝癌細(xì)胞荷瘤鼠模型,在體、內(nèi)外研究蜂毒素對(duì)人肝癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用,并分別通過激活和抑制自噬觀察蜂毒素對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞死亡的作用,明確自噬在蜂毒素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞死亡中的作用和地位。通過對(duì)自噬、凋亡相關(guān)通路蛋白的檢測,探討蜂毒素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞死亡可能的相關(guān)作用機(jī)制,為以后蜂毒素的抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和思路。

　　蜂毒素對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)自噬作用：

　　1、MTT法檢測不同濃度Mel對(duì)人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞分別作用不同時(shí)間的增殖抑制率;通過倒置相差顯微鏡觀察不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞24h細(xì)胞形態(tài)變化;通過AnnexinV-FIFC/PI雙染法檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞24h細(xì)胞凋亡情況;通過臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞24h細(xì)胞的死亡情況。

　　2、WesternBlot分別檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞24h及5μg/mLMel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間后,LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、p62蛋白的表達(dá);透射電鏡檢測5μg/mLMel作用人肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間（0h、24h）后細(xì)胞自噬體的形成情況;免疫熒光檢測5μg/mLMel對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞干預(yù)24h后Beclin1的表達(dá);對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,激光共聚焦檢測Mel對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞LC3的表達(dá)。

　　自噬機(jī)制在蜂毒素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞死亡中的作用：

　　1、MTT法、AnnexinV-FIFC/PI雙染法、臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測自噬抑制劑、自噬激活劑單獨(dú)和聯(lián)合5μg/mLMel對(duì)人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞分別作用24h后的增殖抑制率、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡情況。

　　2、自噬抑制劑單獨(dú)和聯(lián)合5μg/mLMel對(duì)人肝癌HepG2、SMMC-7721細(xì)胞干預(yù)后,WesternBlot檢測Beclin1復(fù)合物及凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。