分子生物學(xué)研究技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）簡介
1、什么是PCR
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，其是一種用于放大擴增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學(xué)技術(shù)。這種技術(shù)模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，能將微量的DNA進(jìn)行特異性的擴增，在短時間內(nèi)獲得足夠的DNA，是分子生物學(xué)研究中不可缺少的一員。
2、標(biāo)準(zhǔn)PCR的過程
此項技術(shù)是模擬DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，在整個PCR過程中包含了變性——退火（復(fù)性）——延伸三個基本反應(yīng)步驟。
- DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
- 退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
- 延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
3、為什么要使用梯度PCR儀呢
梯度PCR儀是指一次性PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件的儀器，因為不同的DNA片段其最適退火溫度不同，采用梯度PCR儀通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達(dá)量高的最適退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行有效的擴增。
在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。
使用普通的PCR儀進(jìn)行擴增時，只能運行一個特定的退火溫度，當(dāng)目的基因的退火溫度不適時，就可能出現(xiàn)假陽性，影響實驗結(jié)果。而對于梯度PCR儀，不但可以作為普通PCR儀使用，也可以通過設(shè)置不同的溫度梯度（通常為12個梯度溫度），研究未知DNA退火溫度的擴增，有效降低或避免假陽性，同時在不理想的工作條件下擴增出產(chǎn)物，既節(jié)約成本也提高了實驗效率。
適用于分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、食品科學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域，進(jìn)行分子克隆、基因表達(dá)分析、基因型鑒定、測序、病原微生物分析等實驗研究。
