細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮��?/b>

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。

一、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

1、掌握凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征；

2、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測(cè)正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法

二、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理：

1、細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。

2、在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會(huì)影響其它細(xì)胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。

3、在生物化學(xué)上，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細(xì)胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長(zhǎng)度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

4、一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度。

三尖杉酯堿（HT）是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

5、細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。