細(xì)胞周期檢測實驗重點說明

細(xì)胞周期是一個高度調(diào)控的過程，使細(xì)胞生長、遺傳物質(zhì)復(fù)制和細(xì)胞分裂成為可能。從一個細(xì)胞周期階段到另一個細(xì)胞周期階段的進展是由運行在細(xì)胞核中的核心細(xì)胞周期機制驅(qū)動的。這一機制是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）及其催化部分（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs））組成的。不同的細(xì)胞cyclin-CDK復(fù)合物在細(xì)胞周期的特定階段被激活并磷酸化其靶蛋白。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白的活性受其細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄、蛋白降解以及CDK抑制蛋白的嚴(yán)格控制。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。如下圖：

G0期：這一期的細(xì)胞稱為休眠細(xì)胞，細(xì)胞暫時脫離分裂周期,不進行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開始DNA合成, 進行細(xì)胞分裂。
G1 期：主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。
S期：這個時期主要合成DNA, 同時還會合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時期合成。
G2期：DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。
M期：RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 染色體高度螺旋化。

細(xì)胞周期檢測的原理：
1、PI法是經(jīng)典的周期檢測方法，PI是碘化丙啶(Propidium)，一種雙鏈DNA的熒光染料，碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可進行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。
2、通常正常細(xì)胞的G0/ G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細(xì)胞用冰乙醇固定通透后，PI可以與細(xì)胞的DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。
因此，可以通過流式細(xì)胞內(nèi)DNA含量進行檢測，將細(xì)胞周期區(qū)分為G1/G0 期，S 期和G2/M 期,并可得出各個時期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

細(xì)胞周期檢測實驗流程：
1、收集細(xì)胞：A: 收集細(xì)胞5~20×105于離心管中，若細(xì)胞比較小(如淋巴細(xì)胞)400 g離心，若細(xì)胞比較大(如腫瘤細(xì)胞)300 g離心，5~10 min，棄去培養(yǎng)液;
2、洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次，離心棄去上清;
固定前處理：利用管底殘留的液體，輕彈管底，將沉淀重懸成細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞成團;
3、細(xì)胞固定：加入約1 ml -20℃預(yù)冷的無水乙醇中，輕輕吹打混勻，-20℃固定1 h或過夜;
4、洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次，300 g離心10min，棄去上清;
5、RNA酶消化：300 g 離心 5 min，吸盡上清后，加入 100 μL 的 RNase A 并充分懸浮細(xì)胞，37°C 水浴 30 min。
6、PI染色：加入400μL的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min;
7、上機檢測：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，低速獲取細(xì)胞，采用分析軟件進行DNA含量分析。

細(xì)胞周期檢測注意事項：
1、培養(yǎng)細(xì)胞注意無菌環(huán)境。
2、染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護。
3、本實驗上機檢測所需收集細(xì)胞量較多，收集細(xì)胞時盡量多收集一些。
4、本實驗對細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地?fù)p傷細(xì)胞。
5、固定時必須預(yù)冷PBS重懸打入無水乙醇中，二者順序不可顛倒。
6、培養(yǎng)細(xì)胞時，以對數(shù)期處理為宜，避免細(xì)胞量過少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實驗誤差。
7、固定后細(xì)胞雖然可以保存較長時間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好及早上機檢測。