非洲豬瘟P54抗體制備方法及核心參數(shù)
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- 以 ASFV P54 蛋白為抗原：可通過原核表達（如大腸桿菌表達重組 P54 蛋白）或真核表達（如昆蟲細胞表達帶修飾的 P54 蛋白，更接近天然構象）獲得高純度抗原，純度需達 90% 以上，避免雜蛋白干擾免疫效果。
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- 選擇 6-8 周齡 BALB/c 小鼠，采用 “基礎免疫 + 加強免疫” 方案：首次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原（劑量 50-100μg / 只），皮下或腹腔注射；2-3 周后用弗氏不完全佐劑加強免疫 2-3 次，最后一次免疫后 3-5 天取血清檢測抗體效價（效價≥1:10000 可進行下一步）。
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- 取免疫小鼠的脾臟 B 淋巴細胞，與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）在 PEG（聚乙二醇）作用下融合，形成雜交瘤細胞；
- 通過 HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞（排除未融合的 B 細胞和骨髓瘤細胞），再用間接 ELISA 法篩選能分泌抗 P54 抗體的陽性克隆。
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- 對陽性雜交瘤細胞采用有限稀釋法或流式細胞術克隆化，確保單克隆性；
- 克隆穩(wěn)定后，可通過小鼠腹腔接種生產(chǎn)腹水型抗體，或通過無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)液型抗體，經(jīng) Protein G/A 親和層析純化，純度可達 95% 以上。
二、P54 單克隆抗體的核心參數(shù)及意義
1. 特異性（Specificity）
- 定義：指抗體僅與 ASFV P54 蛋白結合，而不與其他無關蛋白或病原體蛋白交叉反應的能力。
- 檢測方法：
- 采用 Western blot 檢測抗體與重組 P54 蛋白的結合（應出現(xiàn)單一特異性條帶，分子量約 54 kDa）；
- 檢測與其他豬病毒（如豬瘟病毒 CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV、偽狂犬病病毒 PRV）的結構蛋白是否交叉反應；
- 檢測與健康豬組織蛋白（如肝、脾、腎勻漿）的交叉反應。
- 理想標準：僅特異性識別 ASFV P54 蛋白，與其他病毒及豬自身蛋白無交叉反應，確保診斷特異性。
- 定義：指抗體與非目標抗原（如其他 ASFV 毒株的 P54 蛋白、近緣病毒蛋白）發(fā)生交叉反應的概率，通常以百分比表示。
- 檢測對象：
- 不同 ASFV 基因型毒株（全球已發(fā)現(xiàn) 24 種基因型）的 P54 蛋白（因 P54 高度保守，交叉率應接近 100%，確保對各毒株均有反應）；
- 其他非洲豬瘟相關病毒（如無，因 ASFV 為唯一成員）或干擾病毒（如上述 CSFV、PRV 等，交叉率應≤1%）。
- 關鍵意義：對 ASFV 不同毒株的高交叉率可保證檢測覆蓋范圍，對其他病毒的低交叉率可避免假陽性。
- 定義：指抗體可檢測到的 P54 蛋白最低濃度（或 ASFV 病毒最低滴度），是衡量檢測靈敏度的核心指標。
- 檢測方法：
- 用梯度稀釋的重組 P54 蛋白（如 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL…）通過 ELISA 檢測，以信號值為閾值 2.1 倍時的濃度為 LOD；
- 用梯度稀釋的 ASFV 病毒液（如 10⁶ TCID₅₀/mL、10⁵ TCID₅₀/mL…）通過免疫熒光或膠體金法檢測，確定可識別的最低病毒滴度。
- 典型范圍：優(yōu)質(zhì) P54 單克隆抗體的 ELISA 檢出限通�？蛇_0.1-1 ng/mL（重組蛋白）或10²-10³ TCID₅₀/mL（病毒液），滿足早期感染檢測需求。
- 定義：指抗體在低濃度抗原存在時仍能產(chǎn)生可識別信號的能力，與檢出限直接相關（檢出限越低，靈敏度越高）。
- 實際應用意義：在 ASF 早期感染（病毒載量低）或亞臨床感染階段，高靈敏度抗體可避免漏檢。例如，發(fā)病前 2-3 天的豬血液中病毒含量較低，高靈敏度抗體可通過 ELISA 或膠體金試紙條檢出，為疫情防控爭取時間。
- 評價方式：通過系列稀釋的陽性樣本（病毒液或 P54 蛋白）檢測，計算陽性檢出率（如 LOD 時的檢出率應≥95%）。
- 親和力（Affinity）：指抗體與 P54 抗原的結合強度，通常以平衡解離常數(shù)（Kd）表示，優(yōu)質(zhì)抗體 Kd 應≤10⁻⁸ M（數(shù)值越小，親和力越強），可提高檢測反應速度和穩(wěn)定性。
- 效價（Titer）：指抗體能與抗原發(fā)生可檢測反應的最高稀釋倍數(shù)（如腹水抗體效價通常≥1:10⁵，培養(yǎng)液抗體效價≥1:10⁴），反映抗體濃度和活性。
- 穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性（37℃放置 7 天或 4℃放置 6 個月，效價下降≤20%）和批次間一致性（不同批次抗體的檢出限、特異性差異≤10%），確保產(chǎn)業(yè)化應用的可靠性。
三、參數(shù)優(yōu)化與應用場景
- 膠體金試紙條：需高靈敏度（LOD≤10³ TCID₅₀/mL）、快速反應（親和力高），適合現(xiàn)場快速篩查；
- ELISA 試劑盒：需高特異性（交叉率低）、寬線性范圍（1-1000 ng/mL），適合實驗室定量檢測；
- 病毒分離鑒定：需對各基因型毒株高交叉率，確保不遺漏變異毒株。
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