永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的培養(yǎng)復(fù)蘇和常見問題解答
【細(xì)胞介紹】
HaCaT細(xì)胞是一種人永生化表皮細(xì)胞系，源自一位62歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚組織。這種細(xì)胞系在體外培養(yǎng)后自然轉(zhuǎn)化，獲得了永生化特性，能夠無限期地增殖而不會(huì)自然凋亡。HaCaT細(xì)胞保留了正常皮膚細(xì)胞的特性和功能，表達(dá)角蛋白、角化細(xì)胞交聯(lián)外膜蛋白以及中間絲相關(guān)蛋白，這些蛋白在角質(zhì)形成和皮膚細(xì)胞分化中起著重要的作用。HaCaT細(xì)胞因其在體外分化和增殖的高能力而被用于人表皮細(xì)胞角化的研究，并解決了培養(yǎng)壽命短和細(xì)胞系之間可能遇到的變異等問題。此外，它們也被廣泛應(yīng)用于皮膚生物學(xué)、免疫學(xué)、藥物毒性研究、皮膚疾病研究、化妝品和藥物測(cè)試等領(lǐng)域。
以下是中喬新舟拍攝的HaCaT細(xì)胞拍攝的在不同放大倍數(shù)下的圖片：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：Hacat人永生化表皮細(xì)胞
細(xì)胞別名：HaCAT; HACAT; Hacat
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0044
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)條件：90%DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0044
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
1、細(xì)胞有脫落情況時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細(xì)胞（漂浮細(xì)胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細(xì)胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細(xì)胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細(xì)胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細(xì)胞無變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細(xì)胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細(xì)胞開始脫落，當(dāng)達(dá)到70-80%細(xì)胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細(xì)胞充分解離。
3、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，計(jì)數(shù)，離心收集細(xì)胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞密度為每毫升0.6-2X105。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進(jìn)行換液。
【細(xì)胞凍存】
1、細(xì)胞密度80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1、液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細(xì)胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內(nèi)混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1、細(xì)胞貼壁困難
確保培養(yǎng)基預(yù)熱至37°C；
使用膠原蛋白涂層的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，以提高細(xì)胞貼壁能力；
輕輕吹打細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布。
2.細(xì)胞增殖速度慢
確保培養(yǎng)基中胎牛血清(FBS)的質(zhì)量和濃度(10%)；
檢查二氧化碳濃度和培養(yǎng)溫度是否恒定在5%和37°C；
檢查培養(yǎng)基是否新鮮和正確配制，避免使用長時(shí)間儲(chǔ)存的培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞形態(tài)異常:如變圓或收縮
檢查胰蛋白酶消化時(shí)間是否過長，適當(dāng)縮短消化時(shí)間；
確保培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分充足；
檢查培養(yǎng)環(huán)境的pH值和滲透壓是否適宜。
4、細(xì)胞傳代時(shí)死亡率高
避免過度胰蛋白酶消化，使用適量的胰蛋白酶并及時(shí)終止消化；
使用溫和的細(xì)胞離心速度(150-250g，2-5分鐘)；
傳代時(shí)避免細(xì)胞過度稀釋，保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。
5、細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)和碎片多
更換新鮮的培養(yǎng)基，避免細(xì)胞過度生長導(dǎo)致碎片增加；
傳代時(shí)輕輕吹打細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞損傷。
6、培養(yǎng)基中有大量漂浮細(xì)胞
檢查細(xì)胞是否過度消化或處理不當(dāng)，調(diào)整操作步驟；
定期換液清除漂浮細(xì)胞，保證貼壁細(xì)胞的健康生長。
【注意事項(xiàng)】
該細(xì)胞傳代時(shí)需要消化較長時(shí)間（5~15分鐘），具體時(shí)間因胰酶濃度、效價(jià)、消化條件有所不同，請(qǐng)以細(xì)胞即將脫落為準(zhǔn)。
難消化細(xì)胞可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
【發(fā)表過的文獻(xiàn)】
截至到2024年，引用中喬新舟該細(xì)胞發(fā)表過的文獻(xiàn)總數(shù)45篇，總的影響因子227.87，最高影響因子27.4數(shù)據(jù)如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻(xiàn)，可以參考：
1.論文題目：LysSYL-Loaded pH-Switchable Self-Assembling Peptide Hydrogels Promote Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Elimination and Wound Healing
期刊： ADVANCED MATERIALS 影響因子：27.4
2.論文題目：Dynamic Imine Chemistry Enables Paintable Biogel Electrolytes to Shield On-Body Zinc-Ion Batteries from Interfacial Interference
期刊：Journal of the American Chemical Society 影響因子：14.4
3.論文題目：Hydrogel-Based Treatment of House Dust Mite-Induced Atopic Dermatitis through Triple Cleaning of Mites, Bacteria, and ROS-Related Inflammation
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces 影響因子：8.3
4.論文題目：Skin-adaptive film dressing with smart-release of growth factors accelerated diabetic wound healing
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
影響因子：8.025
5.論文題目：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
期刊：BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY 影響因子：7.5
HaCaT細(xì)胞是一種人永生化表皮細(xì)胞系，源自一位62歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚組織。這種細(xì)胞系在體外培養(yǎng)后自然轉(zhuǎn)化，獲得了永生化特性，能夠無限期地增殖而不會(huì)自然凋亡。HaCaT細(xì)胞保留了正常皮膚細(xì)胞的特性和功能，表達(dá)角蛋白、角化細(xì)胞交聯(lián)外膜蛋白以及中間絲相關(guān)蛋白，這些蛋白在角質(zhì)形成和皮膚細(xì)胞分化中起著重要的作用。HaCaT細(xì)胞因其在體外分化和增殖的高能力而被用于人表皮細(xì)胞角化的研究，并解決了培養(yǎng)壽命短和細(xì)胞系之間可能遇到的變異等問題。此外，它們也被廣泛應(yīng)用于皮膚生物學(xué)、免疫學(xué)、藥物毒性研究、皮膚疾病研究、化妝品和藥物測(cè)試等領(lǐng)域。
以下是中喬新舟拍攝的HaCaT細(xì)胞拍攝的在不同放大倍數(shù)下的圖片：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：Hacat人永生化表皮細(xì)胞
細(xì)胞別名：HaCAT; HACAT; Hacat
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0044
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)條件：90%DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0044
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
1、細(xì)胞有脫落情況時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細(xì)胞（漂浮細(xì)胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細(xì)胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細(xì)胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細(xì)胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細(xì)胞無變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細(xì)胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細(xì)胞開始脫落，當(dāng)達(dá)到70-80%細(xì)胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細(xì)胞充分解離。
3、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，計(jì)數(shù)，離心收集細(xì)胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞密度為每毫升0.6-2X105。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進(jìn)行換液。
【細(xì)胞凍存】
1、細(xì)胞密度80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1、液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細(xì)胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內(nèi)混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1、細(xì)胞貼壁困難
確保培養(yǎng)基預(yù)熱至37°C；
使用膠原蛋白涂層的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，以提高細(xì)胞貼壁能力；
輕輕吹打細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布。
2.細(xì)胞增殖速度慢
確保培養(yǎng)基中胎牛血清(FBS)的質(zhì)量和濃度(10%)；
檢查二氧化碳濃度和培養(yǎng)溫度是否恒定在5%和37°C；
檢查培養(yǎng)基是否新鮮和正確配制，避免使用長時(shí)間儲(chǔ)存的培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞形態(tài)異常:如變圓或收縮
檢查胰蛋白酶消化時(shí)間是否過長，適當(dāng)縮短消化時(shí)間；
確保培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分充足；
檢查培養(yǎng)環(huán)境的pH值和滲透壓是否適宜。
4、細(xì)胞傳代時(shí)死亡率高
避免過度胰蛋白酶消化，使用適量的胰蛋白酶并及時(shí)終止消化；
使用溫和的細(xì)胞離心速度(150-250g，2-5分鐘)；
傳代時(shí)避免細(xì)胞過度稀釋，保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。
5、細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)和碎片多
更換新鮮的培養(yǎng)基，避免細(xì)胞過度生長導(dǎo)致碎片增加；
傳代時(shí)輕輕吹打細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞損傷。
6、培養(yǎng)基中有大量漂浮細(xì)胞
檢查細(xì)胞是否過度消化或處理不當(dāng)，調(diào)整操作步驟；
定期換液清除漂浮細(xì)胞，保證貼壁細(xì)胞的健康生長。
【注意事項(xiàng)】
該細(xì)胞傳代時(shí)需要消化較長時(shí)間（5~15分鐘），具體時(shí)間因胰酶濃度、效價(jià)、消化條件有所不同，請(qǐng)以細(xì)胞即將脫落為準(zhǔn)。
難消化細(xì)胞可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
【發(fā)表過的文獻(xiàn)】
截至到2024年，引用中喬新舟該細(xì)胞發(fā)表過的文獻(xiàn)總數(shù)45篇，總的影響因子227.87，最高影響因子27.4數(shù)據(jù)如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻(xiàn)，可以參考：
1.論文題目：LysSYL-Loaded pH-Switchable Self-Assembling Peptide Hydrogels Promote Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Elimination and Wound Healing
期刊： ADVANCED MATERIALS 影響因子：27.4
2.論文題目：Dynamic Imine Chemistry Enables Paintable Biogel Electrolytes to Shield On-Body Zinc-Ion Batteries from Interfacial Interference
期刊：Journal of the American Chemical Society 影響因子：14.4
3.論文題目：Hydrogel-Based Treatment of House Dust Mite-Induced Atopic Dermatitis through Triple Cleaning of Mites, Bacteria, and ROS-Related Inflammation
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces 影響因子：8.3
4.論文題目：Skin-adaptive film dressing with smart-release of growth factors accelerated diabetic wound healing
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
影響因子：8.025
5.論文題目：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
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