利用11種顏色的光譜分離實(shí)現(xiàn)超多標(biāo)記

利用共聚焦顯微鏡的擴(kuò)展光譜能力和多色混色工具
熒光顯微鏡是生命科學(xué)研究的基本工具，隨著細(xì)胞組織和模式生物多色標(biāo)記策略的發(fā)展而不斷發(fā)展和成熟。分子特異性標(biāo)記多種物種的能力需要適當(dāng)?shù)墓ぞ邅?lái)識(shí)別樣品中的多種熒光標(biāo)簽。

嚴(yán)格分離多個(gè)標(biāo)簽對(duì)于獲得有意義的成分、豐度、結(jié)構(gòu)和功能讀數(shù)至關(guān)重要。這種所謂的超多標(biāo)技術(shù)在揭示組織結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展、腫瘤免疫相互作用和傳染病機(jī)制等關(guān)鍵方面已變得十分突出 [1-4]。

為什么需要超多標(biāo)？

簡(jiǎn)單的多色實(shí)驗(yàn)通常使用三種不同的熒光團(tuán)，它們?cè)诳梢?jiàn)光譜的藍(lán)色、綠色和紅色區(qū)域有不同的發(fā)射。然而，生物樣本和過(guò)程的復(fù)雜性不斷增加，這就在技術(shù)和應(yīng)用方面提出了更高的要求，需要能在中倍數(shù)（大于 10 個(gè)熒光團(tuán)）范圍內(nèi)同時(shí)成像的方法 [5-7]。

挑戰(zhàn)

實(shí)現(xiàn)多重化的一種方法是使用上述藍(lán)、綠、紅熒光團(tuán)對(duì)樣品進(jìn)行迭代染色和成像。然而，這一過(guò)程非常耗時(shí)，而且由于每輪染色都需要進(jìn)行苛刻的處理，可能會(huì)影響樣本的完整性和質(zhì)量。此外，合并數(shù)據(jù)的圖像處理也很麻煩，尤其是在三維組織樣本中。因此，在更復(fù)雜的多重染色應(yīng)用中，在一輪染色中達(dá)到所需的多重染色水平的策略已成為理想選擇。雖然純粹從樣品制備的角度來(lái)看，增加樣品中不同熒光團(tuán)的數(shù)量是研究人員可以完成的任務(wù)，但如何處理多個(gè)熒光團(tuán)激發(fā)或發(fā)射光譜的重疊問(wèn)題，即使對(duì)經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員來(lái)說(shuō)也是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。熒光團(tuán)的交叉激發(fā)和發(fā)射光譜的串?dāng)_或透射使得區(qū)分不同信號(hào)變得尤為困難。因此，樣品上每增加一個(gè)熒光團(tuán)，都會(huì)增加正確分離每個(gè)標(biāo)簽的難度。

研究方法

STELLARIS 共聚焦平臺(tái)就是為這些應(yīng)用而設(shè)計(jì)的。下一代 WLL 超連續(xù)激發(fā)、AOBS、優(yōu)化的光束路徑和多達(dá) 5 個(gè) Power HyD 探測(cè)器同時(shí)工作，實(shí)現(xiàn)了超靈活的光譜能力，確保更大限度地收集來(lái)自每個(gè)相關(guān)標(biāo)記的光子。 集成在 ImageCompass 用戶界面中的光譜非混合工具使復(fù)雜熒光團(tuán)組合的分離成為可能。 

例如，我們概述了在一輪染色和成像中對(duì) 11 種不同熒光團(tuán)進(jìn)行成像的一種方法。我們定義了一組光譜不同的熒光團(tuán)，并通過(guò) STELLARIS 中的線性非混合通道染料分離工具將其分離。為了說(shuō)明這種方法是如何工作的，我們選擇了11種Alexa Fluor（AF）染料，范圍從AF 405 nm到AF 790 nm（圖1），與鏈霉親和素連接。然后，我們將每種熒光團(tuán)與涂有生物素的聚苯乙烯珠子耦合，純化珠子，并將它們的混合物裝入 Prolong Diamond 玻璃蓋玻片上。使用配備了 5 Power HyD 檢測(cè)器的 STELLARIS 顯微鏡對(duì) 11 色樣品進(jìn)行成像（圖 2）。

圖 1：本文使用的與珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激發(fā)光譜（A）和發(fā)射光譜（B）。光譜由 FPbase [8] (www.fpbase.org)生成。
圖 2：（A）11 色微珠（標(biāo)稱直徑 0.8 微米）樣品的原始圖像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分離工具獲得的圖像。AF 405（藍(lán)色）、AF 532（灰色）、AF 594（橙色）、AF 750（青色）、AF 488（淺綠色）、AF 555（黃色）、AF 647（洋紅色）、AF 790（紅色）、AF 514（綠色）、AF 568（紫色）、AF 700（淺黃色）。

為了評(píng)估染料分離的效率，我們量化了不同通道中單個(gè)珠子上每種熒光團(tuán)的串?dāng)_（圖 3）。在理想情況下，每個(gè)珠子只出現(xiàn)在一個(gè)通道中，因?yàn)槲覀冎挥靡环N熒光團(tuán)標(biāo)記它們。為了量化，我們使用了嵌入 Fiji 自動(dòng)閾值處理功能的最大熵算法 [9] [10]，對(duì)每個(gè)通道（圖 3B 中顯示為品紅色）的對(duì)象（珠子，圖 3A）進(jìn)行了分割，并測(cè)量了所有通道的歸一化平均強(qiáng)度。歸一化平均強(qiáng)度值顯示在直方圖中（圖 3C）。我們的分析證實(shí)，每個(gè)熒光團(tuán)都被分配到一個(gè)通道，11 個(gè)不同標(biāo)記的珠子可以清楚地分成各自的通道。

圖 3：評(píng)估 11 色珠樣品圖像中的染料分離效率。使用染料分離工具成像后獲得的通道（A）使用 MaxEntropy Dark 進(jìn)行了閾值化和分割（B）。計(jì)算不同通道之間的串?dāng)_，并繪制每個(gè)通道的串?dāng)_圖 (C)。

總結(jié)
總的結(jié)果是成功地對(duì)與合成珠耦合的 11 種不同熒光團(tuán)進(jìn)行了光譜分離，充分展現(xiàn)了 STELLARIS 共聚焦平臺(tái)在進(jìn)行多重標(biāo)記分析方面的顯著能力。

參考文獻(xiàn)：
[1] IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Radtke, A. J. et al., PNAS, 2020. doi: 10.1073/pnas.2018488117.[2] Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Stack, E. C. et al., Methods, 2014. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016.
[3] Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Tan, W. C., et al., Cancer Comm (Lond), 2020. doi: 10.1002/cac2.12023.
[4] Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Lewis, S. M.,et al.,  Nat. Methods, 2021. doi: 10.1038/s41592-021-01203-6.
[5] Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy. Zimmermann, T., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005. doi: 10.1007/b102216.
[6] Hyperspectral phasor analysis enables multiplexed 5D in vivo imaging. Cutrale, F., et al., Nat. Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4134.
[7] PICASSO allows ultra-multiplexed fluorescence imaging of spatially overlapping proteins without reference spectra measurements. Seo, J., et al., Nat. Comm., 2022. doi: 10.1038/s41467-022-30168-z.
[8] FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Lambert, T. J., et al., Nat. Methods, 2019. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8.
[9] A new method for gray-level picture thresholding using the entropy of the histogram. Kapur, J. N., et al., Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 1985. doi:10.1016/0734-189x(85)90125-2.
[10] Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Schindelin, J., et al., Nat. Methods, 2012. doi:10.1038/nmeth.2019.

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