技術(shù)突破：三光子活體成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)1700μm亞細(xì)胞分辨率成像

該研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等學(xué)者共同完成，文章題為《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在線發(fā)表于《Communications Biology》。

重要發(fā)現(xiàn)
01三光子成像技術(shù)的搭建與優(yōu)化
為了實(shí)現(xiàn)對(duì)mPFC的深層活體成像，研究團(tuán)隊(duì)搭建了一套先進(jìn)的三光子顯微鏡系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用了可調(diào)諧激光（1300-1700nm），激光重復(fù)頻率穩(wěn)定在2MHz，并配備了900-1900nm鍍膜光學(xué)元件，確保長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光的有效傳輸。

關(guān)鍵的技術(shù)優(yōu)化包括：
色散補(bǔ)償，通過(guò)棱鏡補(bǔ)償器減少飛秒激光在光路中的脈沖展寬，提升熒光激發(fā)效率，使1mm深度處的高亮度熒光信號(hào)更豐富，信噪比顯著提高；

物鏡選擇，對(duì)比多款物鏡后，選用了Olympus25x水浸物鏡（數(shù)值孔徑1.05，傳輸波長(zhǎng)至1700nm），其在1mm深度的熒光強(qiáng)度和信噪比表現(xiàn)最優(yōu)；

擴(kuò)大探測(cè)光學(xué)元件尺寸，增加非彈道光子的收集角度（從8°增至14°），進(jìn)一步提升信號(hào)質(zhì)量。這些優(yōu)化讓系統(tǒng)能穿透小鼠顱骨窗口，清晰成像mPFC的各個(gè)區(qū)域和層級(jí)。

對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，團(tuán)隊(duì)通過(guò)表達(dá)GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度觀察到其鈣活動(dòng)，包括離散微域的自發(fā)鈣事件和胞體的鈣變化，且這些活動(dòng)的振幅、持續(xù)時(shí)間和頻率與淺層星形膠質(zhì)細(xì)胞相似，表明深層星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)功能特性具有一致性。

在小膠質(zhì)細(xì)胞研究中，使用1650nm波長(zhǎng)激發(fā)紅色熒光標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞，首次在1100μm深度量化其突起的運(yùn)動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)其周轉(zhuǎn)率為58.9±2%，且連續(xù)兩天成像顯示運(yùn)動(dòng)特性穩(wěn)定，證明該技術(shù)的低侵入性。

此外，研究還實(shí)現(xiàn)了樹(shù)突棘密度的長(zhǎng)期追蹤：在1mm以下深度，連續(xù)一周記錄到樹(shù)突棘密度為0.41±0.07μm⁻¹，為研究神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性提供了新工具。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像的深度瓶頸
傳統(tǒng)雙光子成像受限于光散射，在腦組織中的成像深度通常不足1mm，且難以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率。而本研究的三光子成像技術(shù)通過(guò)采用1300-1700nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，顯著減少了光在深層組織中的散射和吸收，將成像深度提升至1700μm，是雙光子成像的1.5倍以上。這一突破讓科研人員得以探索mPFC等以往難以觸及的深層腦區(qū)，為理解全腦網(wǎng)絡(luò)連接打開(kāi)了新窗口。

總結(jié)與展望
本研究成功開(kāi)發(fā)并應(yīng)用三光子活體成像技術(shù)，在小鼠mPFC實(shí)現(xiàn)了1700μm深度的亞細(xì)胞分辨率成像，首次同時(shí)記錄了神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能特性，突破了傳統(tǒng)成像技術(shù)的深度和侵入性限制。

展望未來(lái)，該技術(shù)將成為探索mPFC在認(rèn)知功能（如工作記憶、情緒調(diào)控）中作用的核心工具，助力揭示阿爾茨海默病、精神分裂癥等疾病的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，其在深層組織成像中的優(yōu)勢(shì)也有望擴(kuò)展到其他器官研究，推動(dòng)整個(gè)生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的發(fā)展，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究帶來(lái)革命性突破。

DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.