從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測器和測量技術（上）

為什么混合探測器允許在更高強度下進行光子計數(shù)，以及為什么直方圖有時看起來會很奇怪

本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測器。“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對單點進行激發(fā)和測量的技術。本文旨在為用戶提供不同技術之間清晰的概覽，并針對不同應用場景給出合適的檢測器選擇建議，而非深入探討專業(yè)細節(jié)。

介紹
首先，本文將簡要介紹光電倍增管（PMT）。在闡述光信號如何轉(zhuǎn)換為電信號的基礎上，進一步探討檢測器捕獲電信號的不同方法。這些方法基本適用于所有檢測器，但轉(zhuǎn)換技術的適用性會因檢測器類型而異。
最后，本文將介紹兩種近年來出現(xiàn)的、部分或全部采用半導體技術的檢測器：雪崩光電二極管（APD）和混合探測器（HyD）。

光電倍增管
這項經(jīng)典技術利用外光電效應，本文將首先對此進行簡要描述。這將有助于理解為何不同材料用于不同目的。增益的產(chǎn)生是通過產(chǎn)生次級電子，然后在多個階段對其進行再次放大。放大過程發(fā)生在所謂的倍增極（dynode）上。最后，產(chǎn)生的眾多電子需要釋放到外部電路，這項工作由陽極完成。
將光子轉(zhuǎn)化為電子（陰極）
外光電效應描述的是光照射（最初為金屬）表面時，表面產(chǎn)生自由電子的現(xiàn)象。最早被觀察到的光電效應是“貝克勒爾效應”，即當浸在導電液體中的電極受到不同強度的光照射時，電極間會產(chǎn)生電勢差[1]。這種效應類似于半導體中觀察到的效應，現(xiàn)在通常被稱為“光伏效應”，也是推動家用屋頂太陽能電池板產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的原因。該技術中不產(chǎn)生自由電子，因此被稱為“內(nèi)光電效應”。內(nèi)光電效應對“雪崩光電二極管”一章中描述的雪崩光電二極管至關重要。
海因里希·赫茲[2]觀察并描述了外光電效應，他發(fā)現(xiàn)紫外光對他的火花間隙（“Tele-Funken”）的產(chǎn)生具有促進作用。威廉·哈瓦克斯[3]繼續(xù)研究了光致電現(xiàn)象，這也是外光電效應一度被稱為哈瓦克斯效應的原因。阿爾伯特·愛因斯坦[4]理解并解釋了這些測量現(xiàn)象。通過復興牛頓的光的粒子理論[5]，他成功解釋了所有無法用波動理論推導出的觀察結(jié)果。
圖1：外部（左）和內(nèi)部（右）光電效應示意圖。在外光電效應中，材料（例如堿金屬）吸收光量子后釋放出一個電子，然后該電子可以被電場加速（例如在真空中）。在內(nèi)光電效應中，光子被吸收后產(chǎn)生一對電荷（電子/空穴）。這些電荷也可以在半導體材料中被加速。
測量照射到單個電極時釋放的電子數(shù)量（即通過第二個電極檢測到的電流），我們發(fā)現(xiàn)該數(shù)量與光的強度成正比。這與光的波動理論相符：電場強度越大，用于釋放電子的能量就越多。然而，考察這些電子的動能（即“初始速度”）時，我們發(fā)現(xiàn)該速度并不取決于光的強度，而僅取決于光的波長。此外，存在一個最大波長，超過該波長則不會再有電子釋放。這個最大波長是陰極材料的固有屬性。這與波動理論的觀點相悖，后者認為只要提供足夠的能量——對于弱光強度的情況，只需照射更長時間——就能夠激發(fā)接收器釋放電子。
圖2：光電子的動能（紅色）和光子能量（藍色）隨波長變化的曲線。圖中數(shù)據(jù)適用于鋅光電陰極。如果光子能量小于功函數(shù)，則不會釋放光電子（能量保持為零）。如果光子能量高于功函數(shù)，則光電子將獲得超出功函數(shù)部分的能量作為動能，并且該電子可以在真空中進一步加速。
這種現(xiàn)象可以通過將光理解為粒子來解釋：在1900年，馬克斯·普朗克引入了“作用量子”的概念，以描述溫度和輻射能量之間的正確關系[6]之后，愛因斯坦將這種量子化概念應用于光能量本身。因此，光被劃分為大小為E=h*c/λ的能量包，其中h是普朗克常數(shù)。如果一個具有特定能量E的光粒子撞擊金屬表面，該能量可以被吸收，并可以將一個電子從陰極材料的結(jié)構(gòu)中釋放出來。然而，要發(fā)生這種情況，光子必須至少具有與將電子束縛在材料中的能量相同的能量。這就是上述由功函數(shù)WA描述的最小能量。能量較低的光粒子無法釋放任何電子，無論單位時間內(nèi)有多少光粒子撞擊表面（即強度）。由于c和h是物理常數(shù)，光子能量僅取決于波長λ，實際上與波長成反比。當波長超過某個值λmin時，光子的能量E=c/λmin將小于功函數(shù)，此時測量儀器將不會顯示任何電流。
波長較短的光子能夠釋放電子，并且我們發(fā)現(xiàn)這些電子的動能與波長呈線性關系，其表達式為：Ekin = h*c/λ – WA，但與輻射強度（光子密度）無關。在較高輻射強度下，最初的變化僅是產(chǎn)生更多的自由電子。
圖2展示了鋅的這一關系。從圖中可以看出，要檢測到光電效應，光的波長至少要短于約280納米。因此，鋅陰極不適用于可見光。所用材料的功函數(shù)應盡可能低。從元素周期表可以看出，堿金屬尤其適用，因為它們的最外層電子與原子核的結(jié)合非常弱。因此，光電陰極的有效成分通常是堿金屬或其混合物（例如Cs、Rb、K、Na）。為了在可見光范圍內(nèi)獲得良好的效果，現(xiàn)在也經(jīng)常在光電陰極材料中使用半導體晶體（例如GaAsP）。更多細節(jié)可在濱松光電倍增管手冊[7]中找到。這也適用于以下所有章節(jié)，尤其是關于光電倍增管特性的部分。
選擇檢測器的關鍵參數(shù)是光電陰極的量子效率，即入射光子數(shù)與產(chǎn)生的光電子數(shù)之比。堿金屬光電陰極在300納米至600納米波長范圍內(nèi)表現(xiàn)良好，在光譜的藍色區(qū)域可達到接近30%的效率。半導體變體的效率可高達50%，可在400納米至700納米（GaAsP）或900納米（GaAs）波長范圍內(nèi)使用。因此，半導體光電陰極越來越多地用于需要較長波長的生命科學應用，因為光學散射是厚樣品的主要問題，且散射程度隨波長的四次方遞減。
由于應用的多樣性，存在大量在光譜靈敏度、量子效率和時間分辨率方面各不相同的光電陰極類型。

乘法（動態(tài)電極）
在光電陰極中，每個入射并有效的光子會釋放出一個電子。當然，測量單個光電子的難度與測量單個光子相當。然而，與光子不同的是，電子極易操控：可以通過直流電壓來增加電子的能量。如果自由電子在放電前通過電壓U，它將吸收能量e*U，該能量以動能的形式添加到電子上（在真空管中）。例如，在1000伏的電勢差下，電子將獲得1000電子伏特（eV）的動能。一個620納米的光子大約具有2 eV的能量。由此可見，通過高電壓加速光電子，可以使“單光子”信號獲得遠高于光子本身能量的能量：這就是信號增益。
圖3：光電倍增管（PMT）的設計和功能示意圖。光子（綠色箭頭）在光電陰極（黃色）處被吸收，觸發(fā)光電子的釋放（藍色）。在級聯(lián)放大器的倍增極（此處為6個倍增極）上，動能被轉(zhuǎn)換為多個自由電子（倍增）。在管的末端，產(chǎn)生的電荷在陽極（黃色）處被測量。
在經(jīng)典PMT中，這種增益分布在多個級之間。在光電陰極后面是一個帶有正電壓的電極，其典型電壓介于50伏和100伏之間。釋放的光電子被該正電位吸引，并沿該方向加速，直到最終撞擊該電極。在此，動能被轉(zhuǎn)換為釋放更多電子（“次級電子”）——這與光電陰極吸收光子后發(fā)生的過程非常相似。典型值為每個入射電子產(chǎn)生2-4個次級電子。
為了產(chǎn)生可測量的電荷，該過程需要在級聯(lián)結(jié)構(gòu)中重復多次，例如，如果每個電極（此處稱為倍增極）產(chǎn)生3個次級電子，則總共會釋放3k個電子，其中k代表倍增極的數(shù)量。典型的PMT大約有10個倍增極，這相當于3^10 = 59,049個電子——一個可測量的電荷約為10 fC。
光電倍增管的整體增益可以通過總高壓進行控制，該高壓通常通過分壓器在各個倍增極之間進行均勻分配。電壓越高，增益越大。每個倍增極釋放的電子數(shù)是一個平均值，可以通過電壓進行連續(xù)調(diào)節(jié)。這就是為什么會出現(xiàn)諸如“2.7個釋放電子”這樣看似奇怪的數(shù)值。
圖4：平均增益為2.7倍時，光電倍增管倍增極釋放次級電子的概率分布。最常見的情況是釋放2個或3個電子，但也可能釋放8個甚至0個電子。由于這些事件在級聯(lián)的倍增極上連續(xù)發(fā)生，因此鏈末端的脈沖分布并不像x軸上的整數(shù)那樣離散。相反，幾乎所有中間值都會被記錄（紅色曲線），從而形成一種準連續(xù)性。然而，這條曲線并非意味著性能更優(yōu)，它只是極高噪聲的結(jié)果。
圖4展示了以2.7個電子為例的頻率分布，描述了到達倍增極的電子實際釋放的電子數(shù)量。大多數(shù)情況下，會釋放1個、2個、3個或4個電子，偶爾甚至更多。在“后期”倍增極，每次前一級倍增極的電子倍增到達時，這些事件都會被平均化，每個脈沖獲得約2.7倍的增益。然而，由于只有一個電子到達第一個倍增極，因此無法在第一個倍增極上取平均值。因此，圖4中的分布是PMT末端脈沖高度分布的近似值，表明該值波動范圍為4到5倍。因此，每個光子的增益量變化很大。這是積分測量方法中噪聲的重要來源（見下文）。這些不同的脈沖高度也會導致光子計數(shù)時的分辨問題。
電子也可能無法擊中目標（下一個電極）。發(fā)生這種情況的階段不同，總電荷的精度會降低，效率也會下降。因此，通常使用“探測效率”一詞，而不是光電陰極的“量子效率”，因為它考慮了整個電子倍增鏈中的損耗。

信號（陽極）
在高壓倍增級放大后，電子最終到達陽極，在那里可以測量電荷。由于電子在管內(nèi)可能采取不同的路徑，它們并非同時到達陽極。因此，電子到達的時間也呈一定分布，這種時間分布反映在理想電脈沖的寬度上。實際上，脈沖形狀很大程度上受測量裝置的影響，測得的脈沖寬度是到達電荷分布與下游電子設備衰減特性的卷積結(jié)果。
圖5：PMT陽極的電荷脈沖形狀。吸收光子（綠色箭頭）后，電荷會在一定時間后迅速增加，然后以較慢的速率下降。光子到達與脈沖峰值之間的時間稱為渡越時間（TT）。脈沖寬度用半峰全寬（FWHM）表示。   
為了描述脈沖形狀，通常使用半峰全寬（FWHM）。對于PMT，F(xiàn)WHM大致在5到25納秒之間。當然，脈沖在陽極的有效時間比FWHM要長，對于10%上升沿到90%下降沿之間的時間，我們可以粗略地估計為FWHM的兩倍。然而，脈沖形狀是不對稱的；上升時間比下降時間快兩到三倍。可以通俗地將其比作狗洗澡后甩掉身上的水滴：水滴數(shù)量先迅速增加，然后逐漸減少——因為剩下的水滴越來越少。
光子到達陰極與輸出脈沖峰值之間的時間稱為渡越時間（TT），其值約為15到70納秒，具體取決于光電管的設計。這是信號在管內(nèi)傳輸?shù)臅r間。渡越時間也在一個平均值附近隨機分布，渡越時間擴展（TTS）為1–10納秒。這是熒光壽命應用的重要參數(shù)，因為它限制了測量的準確性。
即使沒有光子照射到陰極，陽極仍然會以一定的頻率檢測到事件。這些事件大多由陰極發(fā)射的熱電子觸發(fā)。來自倍增極的熱電子也可能導致一些較小的事件。這些事件被歸類為“暗噪聲”，會降低圖像對比度，對于微弱信號而言，這是一個尤其嚴重的問題，因為這些信號可能無法與背景區(qū)分開來。在PMT中，光電陰極和早期倍增極的噪聲會被后續(xù)的倍增級放大。而單級系統(tǒng)中則不存在這種情況。因此，雙級混合探測器（見“混合探測器”一章）產(chǎn)生的倍增噪聲要小得多。

參考文獻：
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