從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測器和測量技術(shù)（中）

本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測器。“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對單點進行激發(fā)和測量的技術(shù)。本文旨在為用戶提供不同技術(shù)之間清晰的概覽，并針對不同應用場景給出合適的檢測器選擇建議，而非深入探討專業(yè)細節(jié)。

測量方法和直方圖
到達陽極的電荷云會產(chǎn)生一個電壓脈沖。更準確地說，施加在高壓上的正電位會被到達的負電荷以脈沖形式略微衰減。此時的電荷是可測量的，但仍然非常微弱。因此，需要進行仔細的設(shè)計以確保獲得有意義的測量結(jié)果�；�本上，有三種不同的測量概念，將在下文概述。這些概念適用于所有類型的檢測器，包括“雪崩光電二極管”和“混合探測器”章節(jié)中描述的雪崩光電二極管和混合探測器。然而，這些方法并非對所有檢測器都同樣適用。

我們在此也想探討一下評估方法，因為用戶與其說是對檢測器的工作原理感興趣，不如說是更關(guān)心這些信號對其測量和研究的意義。

電荷放大器
圖6：檢測器S在吸收一個光量子hν后產(chǎn)生電荷Q。該電荷由一個運算放大器進行累加。運算放大器（OP）確保其反相輸入端（–）的電壓始終等于同相輸入端（+）的電壓。因此，當來自PMT陽極的電荷到達時，會立即通過對電容器C充電來進行補償（紅色圓圈）。然后，電容器上的電荷對應于在整個測量時間內(nèi)到達的電荷，輸出電壓Ua與C成正比，因此可以進行測量。在一個像素的測量結(jié)束后，系統(tǒng)會被重置為零。
測量PMT信號的傳統(tǒng)技術(shù)是使用所謂的電荷放大器。在掃描顯微鏡中，激發(fā)光束持續(xù)掃描樣品，每條掃描線都需要劃分為所需數(shù)量的像素。對于經(jīng)典的結(jié)構(gòu)圖像，典型的記錄時間約為一秒，每幅圖像包含1000條掃描線，每條線包含1000個像素。因此，每個像素的記錄時間約為1微秒。在這1微秒內(nèi)，來自PMT的所有電荷都會在電容器中累積，如圖7所示�？倳r間的一部分會用于重置電荷放大器，以便其在下一個像素的測量時重新從零開始。最終得到一個與從PMT接收的總電荷成正比的電壓。然后，該電壓通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC）轉(zhuǎn)換為“灰度值”。通常使用8位分辨率，即灰度值是介于0和255之間的整數(shù)。通過調(diào)節(jié)PMT的高壓，可以確保測得的信號“落入”這8位范圍內(nèi)，即充分利用整個動態(tài)范圍，而不會因過載而導致信號截斷。
圖7：使用電荷放大器進行測量時，在一個像素的時間段內(nèi)，電荷脈沖（藍色）和積分信號（紅色）的變化。亮度讀數(shù)是最終的積分值。然后在重置階段對電容器進行放電，以便開始下一個像素的測量。
顯然，這些灰度值并不代表絕對亮度值，而只能用于比較不同圖像區(qū)域的相對亮度，或者比較在相同測量設(shè)置下采集的圖像的亮度。如上所述，每個入射光子的信號強度變化很大。在一個圖像元素的亮度測量時間內(nèi)，會有若干甚至許多光子入射。可能的取值是單個光子電荷的所有組合，這些組合本身就是準連續(xù)變化的。因此，累積測量中的光子事件完全模糊，信號強度呈現(xiàn)連續(xù)分布。數(shù)字化過程則將這種連續(xù)分布轉(zhuǎn)換為256個離散的亮度值，即灰度值。
圖8：植物根莖切片的雙通道圖像。感興趣區(qū)域用黃線標出。大部分區(qū)域是黑色背景，在直方圖的左側(cè)區(qū)域，即低灰度值區(qū)域，表現(xiàn)為非常高的峰值。為了使實際信號的直方圖清晰可見，計數(shù)被限制為僅顯示非背景結(jié)果。紅色通道的信號是紅色直方圖中的肩部（介于80和200灰度值之間）。
當然，實驗人員通常并不關(guān)注單個圖像元素的亮度，而是關(guān)注諸如完整細胞或組織成分等結(jié)構(gòu)的強度。因此，他們會選擇一個感興趣區(qū)域（ROI）并獲取其亮度值。根據(jù)圖像分辨率（通常約為1000 x 1000像素，即1百萬像素），數(shù)百甚至數(shù)千個圖像元素會被組合成一個單一的數(shù)值。然后，可以將該平均值與其他結(jié)構(gòu)的值進行比較，或者在活體材料實驗中將其繪制為時間變化曲線等。例如，還可以更精確地分析該區(qū)域內(nèi)的亮度分布。為此，需要生成一個直方圖，統(tǒng)計具有特定亮度的圖像元素數(shù)量。由于有256種不同的亮度級別，因此在8位直方圖的x軸上會顯示從0到255的數(shù)字。由于數(shù)字化過程，這里不存在中間值。因此，嚴格來說，直方圖中不應存在連續(xù)的線條。此外，y軸上繪制的頻率也只能是整數(shù)，這很合理，因為它們代表圖像元素的數(shù)量。圖8展示了一個此類直方圖。我們可以從該直方圖中提取各種細節(jié)；這里我們主要關(guān)注三個屬性。
如果亮度分布是對稱的，則平均亮度值位于直方圖的最大值處。然而，我們經(jīng)常會觀察到某種程度的不對稱性，表明平均值略微偏離最大值，可能偏左或偏右。
對于極端的亮度波動，曲線會變得非常“寬”。如果沒有方差，則只會有一個灰度值，“曲線”將無限窄。因此，寬度是方差的體現(xiàn)。然而，影響這種方差的因素不僅是每次測量時間內(nèi)到達圖像元素的 photons 數(shù)量分布，還包括測量系統(tǒng)的噪聲特性，尤其是PMT以及電子設(shè)備的噪聲。只有當這些噪聲部分足夠小時，才有可能根據(jù)平均值與寬度的比率來估計 contributing photons 的數(shù)量。
由于零點由電子設(shè)備的設(shè)置固定，因此無法從灰度值直方圖中推斷出背景亮度中PMT暗電流的比例。
為了獲得可用的圖像，需要大約為3的信噪比（SNR）。當在圖像元素中記錄到10個光子時，即可達到此信噪比。對于線頻為1 kHz的1百萬像素圖像，這意味著每秒有1000萬個光子入射。然而，通常我們會盡量使用較弱的光照，因為高強度激發(fā)會破壞熒光染料，且產(chǎn)生的分解產(chǎn)物通常對生物體有害。因此，需要降低激發(fā)強度，以在圖像質(zhì)量和樣本穩(wěn)定性之間取得平衡。因此，每個像素通常只記錄到平均1到3個甚至更少的光子。即使信號極其微弱，只要每個像素的平均光子數(shù)遠小于1，仍然可以進行有效的評估。
為什么即使只有10個光子，我們也能獲得遠超過200種不同的灰度值？15種不同的亮度級別難道不夠嗎？如果每個光子在圖像中產(chǎn)生相同的信號，那么15級就足夠了。但是，正如我們上面所述，脈沖高度變化很大（強度存在噪聲）。如果一個像素中累加了多個光子的脈沖，則可能的亮度值數(shù)量會再次增加。這就是亮度級別數(shù)量龐大的原因。而且，使用的級別越多（例如使用約12或16位的較低灰度分辨率），我們就越會放大脈沖變化產(chǎn)生的噪聲。然而，這樣做并不能提供更好的信息。
圖9：上圖：如果圖像中只使用了少量灰度級，則直方圖僅在狹窄的范圍內(nèi)顯示數(shù)值。下圖：如果將這些灰度級乘以一個系數(shù)，以充分利用8位動態(tài)范圍（例如，為了使顯示器上的圖像更易于觀察），則灰度級的數(shù)量保持不變，中間的級別仍然為空，從而導致直方圖中出現(xiàn)“間隙”。

直方圖還提供其他有用的信息。如果在記錄過程中沒有充分利用0到255的完整動態(tài)范圍，而只使用了底部十分之一（0到25），則顯示器上的圖像會非常暗，因為顯示器只使用了0到25的灰度值。我們只能通過“擴展”直方圖來使圖像變亮，這是當今所有數(shù)碼相機都自動提供的常用技術(shù)。這種方法是將每個像素的亮度值乘以相同的系數(shù)Z。在上述情況下，我們需要將所有值乘以10，以覆蓋0到255的范圍。然而，由于最初只有25個不同的值，因此最終圖像中也只有25個不同的值。因此，直方圖會出現(xiàn)間隙；在我們的示例中，所有繪制的灰度值之間都缺少9個值。因此，圖表看起來有些“雜亂”，但數(shù)據(jù)是正確的。
雖然電荷放大器多年來一直用作共聚焦顯微鏡上測量PMT信號的設(shè)備，但它現(xiàn)在已基本被其他技術(shù)取代（見下文）。電荷放大器提供的信號是對整個像素時間內(nèi)的信號進行積分，因此結(jié)果取決于像素時間的長度。然而，如果改變掃描格式（例如，在相同的掃描速度下，每行只記錄100個而不是1000個像素），則像素時間會發(fā)生變化。此時信號會增大10倍，因此需要調(diào)整PMT上的高壓。改變掃描速度也會產(chǎn)生相同的效果。此外，由于電荷放大器的復位需要一定的時間，因此每個像素的測量時間都會損失一部分。在高掃描速度和高分辨率下，像素時間非常短，復位造成的損失會變得顯著。直接數(shù)字化可以解決這個問題。

直接數(shù)字化
圖10：與圖7中相同的光子事件。與高保真技術(shù)類似，PMT輸出端的信號以高頻率直接數(shù)字化（紅色星號）。數(shù)字化頻率（采樣時鐘）設(shè)置得足夠高，以高于測量系統(tǒng)的電子帶寬（“過采樣”），從而確保信號被完整捕獲。

現(xiàn)代數(shù)字化電路的速度足夠快，能夠直接將PMT信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字量。具體方法是通過一個適當阻值的電阻對PMT產(chǎn)生的電荷進行放電，并以高時鐘頻率將由此產(chǎn)生的電壓轉(zhuǎn)換為灰度值。單個圖像元素的數(shù)據(jù)在記錄過程中會立即進行平均，因此，無論記錄一個圖像元素需要多長時間，圖像最終獲得的灰度值都能真實地反映樣本的強度。采用這種方法，無需重新調(diào)整PMT的高壓，可以直接比較亮度值。此外，也不存在因復位而造成的時間損失。
使用直接數(shù)字化方法獲得的直方圖與使用電荷放大器時獲得的直方圖看起來完全相同，并且基本上包含相同的信息。這是因為平均方法本質(zhì)上也是對測量數(shù)據(jù)進行累加，只不過是立即在正確的時間軸上進行縮放。掃描變焦也不會改變圖像亮度，除非是由于不同程度的熒光染料漂白等原因造成的真實亮度變化——但這屬于有價值的信息，而不是測量偽影。漂白現(xiàn)象也可以通過這種方法立即進行量化。
這項技術(shù)的另一個優(yōu)點是不存在因清空存儲器而造成的死時間。這使得在極短的像素時間內(nèi)能夠獲得更好的信噪比。

光子計數(shù)
我們現(xiàn)在可以使用清晰簡潔的直方圖來描述強度。然而，有趣的是，世界遠非如此平滑和連續(xù)。正如馬克斯·普朗克[7]無意中發(fā)現(xiàn)的那樣，光并非以連續(xù)強度的形式存在。因此，我們的探測器測量的是單個事件——光子的到達，而不是連續(xù)的強度值。表面上的連續(xù)性是測量上的模糊性造成的：PMT模擬測量的直方圖顯示的是模糊測量的合并結(jié)果。正如我們已經(jīng)提到的，PMT接收到的每個光子都會產(chǎn)生一個寬度變化的脈沖，其強度先上升后下降。通過對大量寬度和高度不同的脈沖進行積分或平均，可以獲得一個看似連續(xù)的亮度直方圖，其中可以出現(xiàn)任何強度值。此外，這些強度值的數(shù)量取決于數(shù)據(jù)記錄中人為設(shè)定的“灰度深度”。然而，事實并非如此。仔細考慮后會發(fā)現(xiàn)，像素中的亮度不能用有理數(shù)表示。它只能是一個整數(shù)，事實上，它只能是在該像素的測量時間內(nèi)到達探測器的光子確切數(shù)量。因此，與其對每個脈沖的電荷（即脈沖曲線下的面積）進行積分或平均，不如直接計數(shù)到達陽極的電荷脈沖，而不評估脈沖大小。這將解決大部分噪聲問題。
* 事實上，光強也取決于光子的顏色，這會對脈沖高度產(chǎn)生輕微影響。然而，這種能量差異在整個光譜范圍內(nèi)僅約為2電子伏特。與第一個倍增極上約80伏特的電壓相比，這可以忽略不計。對于下文將討論的混合探測器（HyD），這種變化甚至要小一百倍左右。
光電子的初始速度也存在類似情況，正如我們之前提到的，光電子可以從陰極向任何方向發(fā)射。一些光電子會朝著期望的方向運動，而另一些則需要通過改變方向來加速，這會導致它們撞擊倍增極時的動能有所損失。這種動能的變化范圍也在±2電子伏特左右。
圖11：與圖7和圖10中相同的光子事件。對單個光子產(chǎn)生的電荷脈沖進行計數(shù)稱為“光子計數(shù)”。雖然這項技術(shù)產(chǎn)生的噪聲遠低于電荷放大，但它只能應用于高度相似且不會相互重疊的脈沖。此外，較小的脈沖可能無法被識別。

如今，這種計數(shù)器在電子學中已成為標準配置。脈沖的高度或斜率用于激活一個觸發(fā)器，每次觸發(fā)計數(shù)器值加1。在一個像素的測量結(jié)束時，計數(shù)器會被重置為0（這個過程幾乎不耗時），然后重新開始計數(shù)。然而，這種方法的局限性在圖11中顯而易見：脈沖必須能夠被單獨分辨。如果第二個脈沖在第一個脈沖期間發(fā)生，則只會檢測到一個脈沖，導致后續(xù)測量的亮度值偏低。脈沖是否能夠分離取決于脈沖之間的時間間隔和脈沖寬度。較寬的脈沖只適用于較低的亮度，因為否則脈沖之間會過于接近，容易發(fā)生重疊。較窄的脈沖即使在高強度（即較短的脈沖間隔）下也能產(chǎn)生良好的計數(shù)結(jié)果。
典型的PMT輸出的脈沖寬度約為20納秒，可以有效區(qū)分。如果光子總是以相同的時間間隔到達，則計數(shù)率可高達每秒5000萬次（50 Mcps）。然而，由于光子的到達是隨機的，脈沖重疊的概率會大大增加，從而降低了最高計數(shù)率。這里所說的最高計數(shù)率是指，當超過該計數(shù)率時，實際觸發(fā)的光電子數(shù)量與測量到的脈沖數(shù)量之間的關(guān)系不再呈線性。誠然，這是一個取決于誤差容限的任意定義。如果允許的偏差僅為1%，則線性關(guān)系會在0.5 Mcps時結(jié)束；如果允許10%的偏差，則線性關(guān)系會在5 Mcps時結(jié)束。在日常實踐中，1%的精度通常難以達到，而10%則超過了容忍閾值。例如，可以將閾值設(shè)定為6%，從而在計數(shù)率略高于10 Mcps時獲得有效的測量結(jié)果。
如果我們暫時假設(shè)沒有亮度波動（例如，通過照射一個固定點，不進行掃描），則光子平均會均勻地到達探測器，但其到達是隨機的。在這種泊松過程中，光子之間的時間間隔可以用指數(shù)分布來描述。我們無需在此深入探討細節(jié)，只需說明此過程可以用精確的數(shù)學術(shù)語來描述。在一定程度上，我們可以利用它來計算由脈沖重疊引起的、導致線性偏差的誤差。然而，如果已知誤差，我們就可以使用測得的脈沖數(shù)反推實際到達的脈沖數(shù)。這種方法在未經(jīng)校正時誤差變得顯著的脈沖率的五倍范圍內(nèi)有效。因此，這種校正方法被稱為線性化。這是一種用于擴展測量范圍的、廣為人知且有充分描述的方法[7]。

圖 12：圖12：通過校正統(tǒng)計概率實現(xiàn)計數(shù)率的線性化。請注意對數(shù)x軸[6]。
與原始計數(shù)的脈沖（對應于光子）不同，這種線性化方法（類似于展寬）在計算中會產(chǎn)生小數(shù)以及整數(shù)。這反過來會影響直方圖，因為直方圖通常只繪制整數(shù)，例如灰度值。無論如何，這些能量通道的寬度通�？偸呛愣ǖ�，并且總是可以將任何小數(shù)轉(zhuǎn)換為整數(shù)，例如從0開始然后簡單地繼續(xù)計數(shù)。因此，線性化會導致直方圖中出現(xiàn)拍頻效應，從而使個別能量值遠超出直方圖的包絡(luò)線。雖然起初可能令人困惑，但這是對統(tǒng)計校正后的光子數(shù)的精確表示。

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