從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測(cè)器和測(cè)量技術(shù)（下）

本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測(cè)器。“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對(duì)單點(diǎn)進(jìn)行激發(fā)和測(cè)量的技術(shù)。本文旨在為用戶(hù)提供不同技術(shù)之間清晰的概覽，并針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景給出合適的檢測(cè)器選擇建議，而非深入探討專(zhuān)業(yè)細(xì)節(jié)。

雪崩光電二極管
當(dāng)然，目前也已經(jīng)利用半導(dǎo)體技術(shù)制造出了可用于測(cè)量光強(qiáng)的光敏元件。其中，最容易與光電倍增管進(jìn)行比較的器件是雪崩光電二極管（APD）。

將光子轉(zhuǎn)化為電荷對(duì)   
利用半導(dǎo)體測(cè)量光強(qiáng)時(shí)，使用的是內(nèi)光電效應(yīng)。該效應(yīng)是指光子被吸收后，在弱摻雜的半導(dǎo)體材料中產(chǎn)生一對(duì)電荷（自由電子和可擴(kuò)散的“空穴”）。吸收層嵌入在p型和n型摻雜層之間，其作用類(lèi)似于擴(kuò)大了直接pn結(jié)處形成的耗盡區(qū)。該層被稱(chēng)為“i”層，因?yàn)樗�只表現(xiàn)出本征導(dǎo)電性。由于各層的排列順序，這些半導(dǎo)體系統(tǒng)被稱(chēng)為pin二極管。如果在此類(lèi)光電二極管的電極上施加反向偏置電壓，則會(huì)產(chǎn)生與入射光強(qiáng)度在很大范圍內(nèi)成正比的電流。然而，這種二極管對(duì)于弱信號(hào)的靈敏度不夠高，且噪聲較大。

圖13：在雪崩光電二極管中，本征（i）層夾在外部的p型和n型摻雜層之間。光子在此處被吸收并觸發(fā)電荷對(duì)的產(chǎn)生。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，此處僅圖示了一個(gè)電荷。施加的電場(chǎng)將該電荷移動(dòng)到倍增區(qū)（右側(cè)的pn結(jié)）。在此處，會(huì)產(chǎn)生大量新的電荷對(duì)，從而可以在輸出端測(cè)量到一個(gè)脈沖。

雪崩效應(yīng)   
為了能夠測(cè)量更微弱的信號(hào)，在pin結(jié)構(gòu)中增加了一個(gè)額外的層：在i層和n層之間插入另一個(gè)高摻雜的p層。此處形成的極高電場(chǎng)強(qiáng)度使電荷迅速加速，并在撞擊晶格原子時(shí)釋放能量，從而產(chǎn)生更多的電荷（這也是將其與PMT進(jìn)行比較的原因）。這些新產(chǎn)生的電荷也會(huì)被加速，使這一過(guò)程像雪崩一樣迅速擴(kuò)展，并在測(cè)量電路中產(chǎn)生一個(gè)脈沖。如果產(chǎn)生的電荷量適中，雪崩過(guò)程會(huì)自動(dòng)停止，增益可達(dá)10²。在極高的反向電壓下，可以獲得極高的增益（高達(dá)10⁸），但為了避免器件損壞，必須主動(dòng)中斷電流。后一種情況被稱(chēng)為“蓋革模式”，因?yàn)樗�適用于無(wú)需額外放大即可檢測(cè)單個(gè)光子。蓋革模式的缺點(diǎn)是在一次測(cè)量事件后存在較長(zhǎng)的死區(qū)時(shí)間。因此，通常這種模式不適合用于圖像記錄。  
它與光電倍增管（PMT）的不同之處   
與光電倍增管不同，雪崩光電二極管的動(dòng)態(tài)范圍較小，因此需要始終注意被測(cè)光的強(qiáng)度不宜過(guò)高。在非蓋革模式下，其增益在100倍到1000倍之間，具體取決于施加的電壓。另一方面，這種類(lèi)型的檢測(cè)器具有極低的暗電流，使其非常適合檢測(cè)微弱信號(hào)，否則這些信號(hào)在高暗電流的背景噪聲中會(huì)被淹沒(méi)。其光譜靈敏度覆蓋了從300納米到超過(guò)1000納米的寬廣范圍，這也解釋了為什么APD也常用于特別是紅色熒光發(fā)射的圖像記錄。盡管在紅色波段具有極高的靈敏度，但其熱噪聲仍然相對(duì)較小。這種噪聲取決于檢測(cè)器的表面積，APD的表面積最大為0.1平方毫米，而PMT檢測(cè)器的表面積可達(dá)10平方毫米。
APD產(chǎn)生非常窄的脈沖，這是光子計(jì)數(shù)的一個(gè)重要特性。然而，這一特性只能在非蓋革模式下利用，因?yàn)樵谏w革模式下，由于極長(zhǎng)的死區(qū)時(shí)間（幾十納秒），這一優(yōu)勢(shì)會(huì)喪失。

混合探測(cè)器   
如果能夠?qū)�PMT的高動(dòng)態(tài)范圍與APD的速度和低噪聲結(jié)合起來(lái)，那將是非常理想的。而混合探測(cè)器（HyD；也稱(chēng)為HPD：混合光電探測(cè)器或HPMT：混合光電倍增管）正是通過(guò)結(jié)合真空管和半導(dǎo)體組件的嵌合技術(shù)實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)。 該組件中兩種技術(shù)的結(jié)合確實(shí)產(chǎn)生了一種兼具PMT和APD最佳特性的檢測(cè)器。

設(shè)計(jì)   
HyD的“輸入”部分與PMT完全相同：真空管中的光電陰極通過(guò)吸收光子釋放光電子。通常使用GaAsP光電陰極——這也是生物醫(yī)學(xué)熒光應(yīng)用中使用的PMT最合適的陰極類(lèi)型。然而，與PMT不同的是，HyD中的光電子不是分階段加速的，而是在一個(gè)單一步驟中經(jīng)過(guò)超過(guò)8000伏特的電位差進(jìn)行大幅加速。
由此可見(jiàn)，相對(duì)脈沖高度的差異遠(yuǎn)小于PMT，后者到第一倍增極的加速電壓約為100伏。正如“光電倍增管”一章所述，第一倍增極釋放的電子數(shù)量在2到4個(gè)之間，預(yù)期方差為1到2個(gè)電子。這就是為什么PMT的脈沖高度通常變化3到5倍的原因。相比之下，混合探測(cè)器中的光電子被8千伏的電壓加速，從動(dòng)能轉(zhuǎn)換中獲得約1500個(gè)次級(jí)電子。因此，變化約為40個(gè)電子（√1500）。雖然這肯定比2到4個(gè)電子要多，但僅占1500的3%。因此，輸出脈沖非常均勻，能夠更準(zhǔn)確地反映激發(fā)能量。
圖14：混合探測(cè)器（HyD）的設(shè)計(jì)。與光電倍增管類(lèi)似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產(chǎn)生一個(gè)自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導(dǎo)體材料中轉(zhuǎn)換為電荷對(duì)，并在倍增層（pn）中再次放大。

圖14：混合探測(cè)器（HyD）的設(shè)計(jì)。與光電倍增管類(lèi)似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產(chǎn)生一個(gè)自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導(dǎo)體材料中轉(zhuǎn)換為電荷對(duì)，并在倍增層（pn）中再次放大。

使用 HyD 進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄   
由于單步加速和隨后的直接放大，電荷的軌跡變化要小得多，這意味著HyD產(chǎn)生的脈沖比PMT產(chǎn)生的脈沖更加銳利：脈沖寬度減少了約20倍，約為1納秒（目前已接近½納秒）。
此外，由于沒(méi)有倍增極以及光電陰極的尺寸小得多，暗事件也大大減少。與光電倍增管相比，背景噪聲也顯著降低。除了提高記錄圖像的對(duì)比度之外，這還允許對(duì)更多圖像進(jìn)行平均或累積。由于背景幾乎完全是黑色的，因此當(dāng)大量圖像合并成一個(gè)圖像時(shí)，背景仍然保持黑色，這使得在高對(duì)比度下顯著降低信號(hào)噪聲成為可能。 因此，混合探測(cè)器具有諸多優(yōu)勢(shì)。其均勻且窄的脈沖允許在光電流強(qiáng)度下進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，而這種光電流強(qiáng)度很快就會(huì)使PMT過(guò)飽和。
因此，即使是對(duì)于“普通”的圖像記錄，也應(yīng)該考慮使用處于光子計(jì)數(shù)模式的混合探測(cè)器。畢竟，正如“光子計(jì)數(shù)”一章所述，與模擬檢測(cè)技術(shù)相比，光子計(jì)數(shù)具有許多優(yōu)勢(shì)。
圖15：與圖7、10和11中描述的事件過(guò)程相同，但此處使用的是混合探測(cè)器，相比普通PMT，它具有更高的帶寬和更恒定的脈沖高度。顯著提高的脈沖分辨率使得能夠分辨間隔更緊密的脈沖（即在光子計(jì)數(shù)模式下可以記錄更高的光強(qiáng)度）。此外，也不會(huì)遺漏小的脈沖。

因此，評(píng)估結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生被噪聲“污損”的直方圖和準(zhǔn)連續(xù)的直方圖，而是如預(yù)期的那樣，產(chǎn)生定義清晰的、僅包含少量光子的頻率分布。圖9展示的就是這樣一種直方圖。頂部顯示的是每個(gè)像素平均10個(gè)光子的泊松分布。
利用混合探測(cè)器，徠卡TCS SP8系統(tǒng)提供了三種不同的數(shù)據(jù)記錄技術(shù)供用戶(hù)自由選擇。首先，可以將光子計(jì)數(shù)的原始數(shù)據(jù)直接用作圖像信息（“光子計(jì)數(shù)”模式）。由于該模式不使用線(xiàn)性化方法，因此最大計(jì)數(shù)率低于線(xiàn)性化數(shù)據(jù)，但仍然顯著高于傳統(tǒng)光電倍增管。獲得的速率約為60 Mcps（兆計(jì)數(shù)/秒）（詳見(jiàn)“光子計(jì)數(shù)”章節(jié)）。
如果通過(guò)上述的數(shù)學(xué)線(xiàn)性化方法對(duì)計(jì)數(shù)事件進(jìn)行校正，最大計(jì)數(shù)率將提高5倍，可以記錄高達(dá)300 Mcps的亮度。在這種情況下，光子可以轉(zhuǎn)換為不一定是整數(shù)的值，因此最好立即進(jìn)行縮放處理，以使亮度值與傳統(tǒng)檢測(cè)器具有可比性，并適合在顯示器上進(jìn)行平衡顯示。該方法是標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用的方法。請(qǐng)注意，由于展寬和舍入效應(yīng)，直方圖可能看起來(lái)“奇怪”。但是，在評(píng)估圖像亮度時(shí)測(cè)量的數(shù)據(jù)仍然是正確的。
為了更好地呈現(xiàn)所使用的總動(dòng)態(tài)范圍，還可以對(duì)數(shù)值進(jìn)行調(diào)整，以減少明亮像素的影響并增加黑暗像素的影響。這類(lèi)似于HDR渲染的效果。這種模式被稱(chēng)為“Bright R”，用于顯示亮度差異很大的圖像，以避免明亮區(qū)域出現(xiàn)眩光，并使黑暗區(qū)域保持可見(jiàn)。例如，細(xì)胞體中含有大量染料而樹(shù)突非常細(xì)的神經(jīng)元就屬于這種情況。


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