免疫組化技術(shù)發(fā)展歷程：從探索到精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的跨越

免疫組化，作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)，其發(fā)展歷程見證了人類對(duì)生命奧秘不斷探索的腳步。從最初對(duì)抗體 - 抗原反應(yīng)的懵懂認(rèn)知，到如今成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷和研究的重要工具，免疫組化的每一步發(fā)展都凝聚著無數(shù)科研人員的心血與智慧。

一、抗體發(fā)現(xiàn)

抗體的發(fā)現(xiàn)堪稱生命科學(xué)領(lǐng)域的一份珍貴禮物。在人類與疾病抗?fàn)幍穆�長(zhǎng)歷史中，科學(xué)家們逐漸認(rèn)識(shí)到抗體在免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)抗體 - 抗原反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生沉淀，這一現(xiàn)象引發(fā)了科學(xué)家們對(duì)抗體本質(zhì)的深入思考。Heidelberger，這位現(xiàn)代免疫學(xué)之父，在 1920 年基于氮檢測(cè)原理證明了抗體 - 肺炎球菌多糖復(fù)合物中含有氮，進(jìn)而推論抗體可能是一種蛋白質(zhì)。盡管 Heidelberger 的方法存在一定局限性，無法準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)到的氮來源于抗原還是抗體，但他的探索為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

隨后，Heidelberger 和 Kendall 發(fā)明了染色方法，通過使用紫色偶氮染料標(biāo)記沉淀雞蛋白蛋白，當(dāng)特異性抗體添加后，抗原 - 抗體沉淀復(fù)合物第一次有了顏色，這一突破使得對(duì)抗原 - 抗體結(jié)構(gòu)、結(jié)合機(jī)制的研究得以進(jìn)一步深入。1934 年，Marrack 提出大部分抗原是多價(jià)的，抗體是二價(jià)的，他首次在抗體上標(biāo)記染料，制造了紅色標(biāo)記的前傷寒和抗霍亂抗體，為免疫組化技術(shù)的發(fā)展邁出了重要一步。

二、標(biāo)記技術(shù)的興起

標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，如同為免疫組化插上了翅膀，使其發(fā)展進(jìn)入了廣闊天地。早期，研究人員使用常規(guī)染料對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)存在信號(hào)弱的問題。1941 年，微生物學(xué)家 A.H.Coons 首次將一種熒光素（異氰酸熒光素）標(biāo)記在抗肺炎球菌抗體上，可在紫外照射下示蹤小鼠組織中的肺炎球菌，極大地增強(qiáng)了標(biāo)記抗體的信號(hào)，開啟了免疫組化熒光標(biāo)記的大門。

然而，異氰酸熒光素標(biāo)記方法操作困難，效果不穩(wěn)定，如組織在紫外照射下容易有藍(lán)色和紅色背景干擾。經(jīng)過不斷改進(jìn)，1958 年 Riggs 等制備了穩(wěn)定的熒光素異硫氰酸酯（FITC）用于標(biāo)記抗體，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定性與特異性的增強(qiáng)。FITC 標(biāo)記原理是 FITC 的氨基 - NH2 與 FITC 中的碳酰胺基 - C = S 相結(jié)合，這種標(biāo)記方法在免疫組化中得到了廣泛應(yīng)用。

在抗體結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，人們發(fā)現(xiàn) IgG 可變區(qū)有兩個(gè)可以與抗原結(jié)合的區(qū)域，因此標(biāo)記可以在恒定區(qū)進(jìn)行。FITC 直接標(biāo)記在抗 IgG 分子的 Fc 片段（恒定區(qū)），即直接法，這種方法使得抗體可以直接與組織或細(xì)胞中的抗原發(fā)生反應(yīng)，也被稱為一步標(biāo)記，至今仍在某些領(lǐng)域被使用。

三、技術(shù)演進(jìn)

直接法雖然簡(jiǎn)單直接，但存在需要高效價(jià)的一抗且成本高的問題。為解決這一難題，研究人員將一抗作為抗原看待，先用一抗 IgG 去免疫體型較大的動(dòng)物，獲得較多的 Anti - IgG 抗體，然后在二抗上標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)放大效果，這就是間接法。

隨著熒光標(biāo)記免疫組化的發(fā)展，到 20 世紀(jì) 60 年代，熒光依然在使用，同時(shí)也出現(xiàn)了多種常用熒光素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、得克薩斯紅（Texas Red）、Cy3、Cy5 等。然而，熒光標(biāo)記抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)施要求較高，需要熒光顯微鏡，且存在熒光淬滅等問題。

為在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)免疫組化，19 世紀(jì) 60 年代中葉，酶標(biāo)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。酶與一抗或二抗標(biāo)記，結(jié)合后可以特異識(shí)別自身底物，顏色產(chǎn)物可在普通顯微鏡下觀察。最初，人們使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記酶，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。1967 年，研究人員找到穩(wěn)定的辣根過氧化物酶，并對(duì)其偶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行描述。

酶標(biāo)技術(shù)不斷發(fā)展，同時(shí)免疫電鏡技術(shù)也取得進(jìn)展，放射性和金屬標(biāo)記被用于抗體標(biāo)記，如 1959 年 Singer 首先建立了用鐵蛋白標(biāo)記抗體的方法，使人們?cè)陔婄R下對(duì)細(xì)胞抗原進(jìn)行精確定位。但酶標(biāo)技術(shù)早期也存在一些問題，如辣根過氧化物酶不能標(biāo)記所有的抗體，無法解決抗體去除等問題。

為解決這些問題，研究人員提出了三明治法（過氧化物酶三步法），引入用過氧化物酶抗 - 氧化物復(fù)合物，原理如下：相當(dāng)于增加一個(gè)過氧化物酶標(biāo)記點(diǎn)，提高了敏感性。在這一過程中，沒有使用化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記，唯一的缺點(diǎn)在于方法的復(fù)雜性提升了敏感性和特異性。

1983 年，PAP 技術(shù)（Peroxidase - antiperoxidase，PAP）出現(xiàn)，其原理與上述方法類似，但進(jìn)一步優(yōu)化了檢測(cè)過程。然而，由于抗原 - 抗體反應(yīng)在洗滌過程中抗體被洗脫的可能性，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏性降低。1981 年，人們?cè)O(shè)計(jì)了利用生物素和卵白素之間高度親和的特點(diǎn)，產(chǎn)生了親和素 - 生物素復(fù)合物法（avidin - biotin complex method，ABC 法），該方法在國(guó)內(nèi)免疫組織化學(xué)實(shí)踐中主導(dǎo)了 20 多年。

此后，在 ABC 法的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了 SP、LSAB 及 SABC 法，這些方法的主要特點(diǎn)是用鏈霉菌卵白素或生物素 ABC 法中的卵白素，由于鏈霉菌卵白素或生物素幾乎不與組織中的內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，因而產(chǎn)生低背景、高放大與檢測(cè)效果，同時(shí)避免了與組織內(nèi)的內(nèi)源性生物素相結(jié)合而產(chǎn)生非特異染色。

四、展望未來

進(jìn)入 21 世紀(jì)，免疫組化技術(shù)繼續(xù)發(fā)展，酶聚合物法在右旋糖酐上用間接法進(jìn)行染色，其特異性較第一代優(yōu)于過去的方法，如 EnVision、PowerVision 等方法。關(guān)注用作標(biāo)記物的酶有過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。酶與 Ig 均為蛋白質(zhì)，都有較多的氨基，不能直接用臺(tái)交聯(lián)，必須通過一個(gè)交聯(lián)劑（3 - CH2）將它的兩個(gè)醛基伸出（ - CHO 分別與 IgG 的 NH2 及酶的 - NH2 結(jié)合），這樣就把不同的蛋白質(zhì)連接在一起了。

免疫組化技術(shù)從誕生到不斷發(fā)展完善，始終圍繞著解決檢測(cè)靈敏性、特異性以及操作便利性等問題展開。如今，免疫組化已廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷、病理研究、藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域，成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)不可或缺的重要工具。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，如與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合、自動(dòng)化設(shè)備的應(yīng)用等，免疫組化技術(shù)將在未來為人類健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)，幫助我們更深入地理解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的疾病診斷和治療。