一種整合DDA-PRM-dMRM的新方案實(shí)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)HCPs的定性定量分析

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物治療藥物中與工藝相關(guān)的關(guān)鍵雜質(zhì)，會(huì)影響藥物的穩(wěn)定性和安全性。治療性蛋白與殘留HCPs成分的動(dòng)態(tài)范圍極大，往往大于5個(gè)數(shù)量級(jí)，導(dǎo)致高風(fēng)險(xiǎn)HCPs檢測(cè)更加困難。LC-MS/MS檢測(cè)可以突破傳統(tǒng)免疫分析方法在靈敏度和特異性方面的局限性，已成為有效檢測(cè)和定量HCPs的關(guān)鍵工具，可指導(dǎo)下游純化工藝并監(jiān)測(cè)HCPs清除效果。
 
2025年6月，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的張金蘭教授課題組在Journal of Proteome Research發(fā)表了一套新的HCPs監(jiān)測(cè)方法^[1]，首先通過(guò)數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）構(gòu)建包含所有潛在HCPs的CHO細(xì)胞蛋白庫(kù)，然后對(duì)38種已報(bào)道的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs進(jìn)行了平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）交叉驗(yàn)證，最終篩選出28種高風(fēng)險(xiǎn)HCPs及其特異性肽段和離子對(duì)信息。下一步建立并驗(yàn)證了一種新的動(dòng)態(tài)MRM（dMRM）方法，可以同時(shí)定量28種高風(fēng)險(xiǎn)HCPs。最后，應(yīng)用上述策略分析了五個(gè)純化的單克隆抗體制備工藝樣品，通過(guò)DDA方法對(duì)未知HCPs進(jìn)行全面分析，使用dMRM方法對(duì)28種已知高風(fēng)險(xiǎn)HCPs進(jìn)行快速定量�？傮w而言，該策略能夠?qū)σ阎�和未知HCPs進(jìn)行全面分析，指導(dǎo)生物制藥工藝的優(yōu)化。本研究中DDA數(shù)據(jù)分析使用PEAKS Studio完成。

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潛在宿主細(xì)胞蛋白庫(kù)構(gòu)建
許多研究?jī)A向基于數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）的方法來(lái)檢測(cè)HCPs，這樣可以減少低豐度信號(hào)的缺失，提高蛋白質(zhì)組的覆蓋深度，但DIA的譜圖處理更加復(fù)雜，也容易受到復(fù)雜基質(zhì)的信號(hào)干擾。本研究中，作者選擇了以DDA的方式構(gòu)建HCPs蛋白質(zhì)譜圖庫(kù)，基于該庫(kù)直接生成PRM/MRM離子對(duì)列表，可確保工藝開發(fā)階段方法的一致性。為確保對(duì)低豐度HCPs鑒定的全面性，作者對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞提取的全蛋白溶液，采用了兩種不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS試劑盒。結(jié)果顯示，EasyPep MS試劑盒處理的樣本蛋白鑒定更多。最終采用EasyPep MS試劑盒、400ng質(zhì)譜進(jìn)樣和150min梯度的方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（Figure S1）。最終構(gòu)建了一個(gè)包含6863個(gè)蛋白質(zhì)、143166條多肽的譜圖庫(kù)，超過(guò)了目前已報(bào)道的CHO細(xì)胞蛋白庫(kù)。
 

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高風(fēng)險(xiǎn)HCPs預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
在上述已建立的譜圖庫(kù)基礎(chǔ)上，作者又整合了NIST CHO多肽譜圖庫(kù)，然后利用整合后的譜圖庫(kù)，在已報(bào)道的38種高風(fēng)險(xiǎn)HCPs中，預(yù)測(cè)出了36種蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通過(guò)PRM和MRM對(duì)這36種蛋白的特異性肽段進(jìn)行了交叉驗(yàn)證，有效消除了背景和非特異性肽段的干擾，排除了在MRM和PRM數(shù)據(jù)中譜峰均較差的8個(gè)蛋白，最終驗(yàn)證了28種高風(fēng)險(xiǎn)HCPs的47條unique peptides和141個(gè) transitions（Table 2）。Figure 2展示了六類高風(fēng)險(xiǎn)HCPs中代表性肽段的b/y離子碎裂譜圖、PRM和MRM色譜圖。這些transitions在PRM模式下具有高特異性，在MRM模式下具有出色的靈敏度和重現(xiàn)性，確保了定量的可靠性。

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方法驗(yàn)證
在生物制藥下游生產(chǎn)中，去除殘留的HCPs對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。大多數(shù)單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)工藝需要將雜質(zhì)降低至100ppm以下，不過(guò)某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的情況下仍然影響產(chǎn)品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了驗(yàn)證（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之間）。首先篩選出28個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)HCPs中響應(yīng)最高的28條peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(¹³C₆¹⁵N₄-R)作為內(nèi)標(biāo)（IS）。為了模擬實(shí)際樣品狀態(tài)并將干擾降至最低，選擇以人血漿來(lái)源的IgG作為基質(zhì)，然后配置至少6個(gè)濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的相關(guān)系數(shù)R²超過(guò)0.98。結(jié)果如Table S3所示，10種肽具有良好的線性（0.1 – 100nmol/L），21種肽的定量下限低于1 nmol/L），25種肽的上限達(dá)到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的線性范圍較窄外，所有肽均涵蓋了下游純化過(guò)程中典型的HCP濃度范圍。此外，作者又在實(shí)際條件下對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證，包括在室溫（RT）下24小時(shí)的短期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性（從−80°C到室溫的三個(gè)凍融循環(huán)）以及在4°C下7天的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。所有肽在相對(duì)誤差（RE）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）±15.0%范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。所有驗(yàn)證結(jié)果均符合中國(guó)藥典對(duì)生物樣品的標(biāo)準(zhǔn)，這充分證明了該方法對(duì)28種高風(fēng)險(xiǎn)宿主細(xì)胞蛋白進(jìn)行精確定量的穩(wěn)健性，適用于生物制藥過(guò)程監(jiān)測(cè)和質(zhì)量控制。

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方法應(yīng)用
作者將上述方法應(yīng)用于VEGF單克隆抗體下游純化的5個(gè)樣本，檢測(cè)其中的28種已知的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs。DDA模式在細(xì)胞培養(yǎng)液（HCCF）中鑒定到1533種HCPs，在純化后的原料藥中鑒定到38種（Figure 4）。此外，DDA方法鑒定出了一些未被dMRM覆蓋的高風(fēng)險(xiǎn)HCP（如G3GTT2和A4URF0），為全面表征HCP提供了補(bǔ)充信息，并證明了其在監(jiān)測(cè)未知高風(fēng)險(xiǎn)HCP方面的關(guān)鍵價(jià)值。蛋白A親和層析和親和沉淀過(guò)濾（ADF）的去除效率分別達(dá)到74%和91%，表明它們?cè)谇宄鼿CP方面的有效性。陽(yáng)離子交換層析（CEX）階段沒(méi)有顯著變化。值得注意的是，一些在HCCF中未檢測(cè)到的HCP在下游純化過(guò)程中被檢測(cè)到，這可能是因?yàn)榛�質(zhì)干擾減少增強(qiáng)了低豐度分子的信號(hào)響應(yīng)。在最終藥物中，仍檢測(cè)到三種低ppm水平的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它們可能導(dǎo)致聚山梨酯和藥物降解，甚至增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。盡管這三種HCPs在蛋白A親和層析后顯著減少，但在后續(xù)步驟中其清除率趨于平穩(wěn)，這揭示了當(dāng)前純化流程中的選擇性局限性。

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總結(jié)
該研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（驗(yàn)證特異性）和 dMRM（快速定量已知高風(fēng)險(xiǎn) HCPs）的不同方法，實(shí)現(xiàn)了HCPs的全面分析，為生物制藥過(guò)程中HCPs的監(jiān)測(cè)提供了高效、全面的解決方案，助力優(yōu)化純化工藝、提升藥物質(zhì)量可控性，符合QbD理念。但目前僅基于 CHO-K1 細(xì)胞系，可能無(wú)法覆蓋其他 CHO 亞型或變異株的 HCPs，未來(lái)可擴(kuò)展至其他宿主細(xì)胞系或微生物表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合人工智能和深度學(xué)習(xí)，擴(kuò)展低豐度 HCPs的特征譜圖數(shù)據(jù)，建立HCP譜圖庫(kù)共享平臺(tái)。
 
文獻(xiàn)
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369

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