PCR反應(yīng)的過(guò)程控制中的難點(diǎn)和解決方案

 
引言

PCR是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一，常做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)或許認(rèn)為非常簡(jiǎn)單，但對(duì)新人來(lái)說(shuō)其實(shí)并不是那么友好。今天小編來(lái)分享下曾經(jīng)踩過(guò)的那些坑（血淚史）……

 
首先，優(yōu)質(zhì)的模板是成功反應(yīng)的前提。優(yōu)質(zhì)的模板需滿足以下幾點(diǎn)：高純度、足夠的長(zhǎng)度、適宜的濃度。核酸純度可以用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)的兩個(gè)比值來(lái)衡量（260/280和260/230）。當(dāng)然超微量也可以檢測(cè)核酸的濃度，但不能有效反應(yīng)核酸的長(zhǎng)度。常見(jiàn)的動(dòng)物血液、組織、或者植物組織用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度沒(méi)有問(wèn)題，但石蠟包埋樣本或者石蠟切片樣本檢測(cè)就需慎重，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度的同時(shí)需要輔助其他手段驗(yàn)證其濃度是否準(zhǔn)確，比如跑膠看一下是否有明亮光影區(qū)（包埋樣本提取的核酸在所需長(zhǎng)度附近有明亮的片狀光影就OK了，基本沒(méi)有條帶一說(shuō)）或者用染料法（Qubit）復(fù)測(cè)一下。最后再說(shuō)一下適宜的濃度，擴(kuò)增試劑說(shuō)明書(shū)中規(guī)定模板添加體積的同時(shí)大多也會(huì)說(shuō)明投入核酸的總量，這時(shí)就需要根據(jù)核酸的濃度進(jìn)行簡(jiǎn)單的計(jì)算，不足的體積用水補(bǔ)足，投入反應(yīng)的核酸過(guò)多反而會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。如果提取的核酸濃度過(guò)低，就只能適當(dāng)?shù)臄U(kuò)大添加體積，不過(guò)要適量，擴(kuò)大反應(yīng)體積的同時(shí)也意味著dNTPs、酶、引物等濃度的下降，進(jìn)而影響擴(kuò)增體系的性能。

 
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其次，搭配合理的反應(yīng)體系是成功反應(yīng)的保障。PCR反應(yīng)的五要素，除了模板其余四項(xiàng)都能歸入反應(yīng)體系的范疇。常規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)中，引物的濃度相對(duì)固定，所以只要找市場(chǎng)上口碑不差的合成公司來(lái)合成基本不會(huì)有什么問(wèn)題。需要注意的是，引物如果溶了應(yīng)立即分裝凍存，最小分裝量根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)所需體積自行確定。切忌引物溶解后不進(jìn)行分裝，整管凍存，反復(fù)凍融個(gè)三五次后效果就會(huì)下降不少。鎂離子、DNA聚合酶、dNTPs三者的相關(guān)性較高。dNTPs會(huì)結(jié)合鎂離子，被結(jié)合的鎂離子就無(wú)法再和DNA聚合酶結(jié)合，無(wú)法激活DNA聚合酶的活性。所以鎂離子的摩爾濃度一定要大于dNTPs的總濃度，但過(guò)高濃度的鎂離子在提高酶活和產(chǎn)物量的同時(shí)也提高了PCR反應(yīng)的錯(cuò)配率。所以如果PCR反應(yīng)結(jié)束后需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序研究就不推薦較高的鎂離子濃度。dNTPs也是類似，較高濃度有助于獲得更多的擴(kuò)增產(chǎn)物，但也會(huì)提高反應(yīng)的錯(cuò)配率。至于聚合酶，現(xiàn)在市場(chǎng)化的商品更青睞于混酶（高保真酶和Taq酶混合）既兼顧擴(kuò)增反應(yīng)的保真又保證了最終產(chǎn)物的得率。概括下來(lái)，PCR的反應(yīng)產(chǎn)物若是需要進(jìn)行測(cè)序研究就推薦相對(duì)低濃度鎂離子、dNTPs的反應(yīng)體系，讓堿基序列高度保真；若是僅看擴(kuò)增曲線或者產(chǎn)物條帶的話就推薦較高濃度的鎂離子、dNTPs的反應(yīng)體系，保證有更多/高的產(chǎn)物、信號(hào)。注：PCR反應(yīng)本身存在極低的錯(cuò)配率，對(duì)于分析產(chǎn)物的條帶大小或者qPCR的熒光信號(hào)分析不會(huì)有影響。但若進(jìn)行測(cè)序分析就需要考慮將錯(cuò)配率降至不影響測(cè)序結(jié)果的水平。

最后，相匹配的反應(yīng)程序是成功反應(yīng)的橋梁。模板在一次次的升降溫循環(huán)中完成自身的復(fù)制過(guò)程。常見(jiàn)的95℃變性、55℃退火、72℃延伸適用于大多數(shù)反應(yīng)，可以得到所需的目標(biāo)產(chǎn)物。但具體到某一實(shí)驗(yàn)時(shí)，還需根據(jù)引物的Tm值對(duì)反應(yīng)的溫度進(jìn)行微調(diào)，降低非特異擴(kuò)增、增加目標(biāo)產(chǎn)物，以期達(dá)到最佳的反應(yīng)效果。

 
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