細胞凍存及復蘇操作步驟

細胞凍存：
1.  配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。
2.  取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。
3.  離心1 000 rpm，5 min。
4.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5.  將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。
6.  在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
7.  凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
      
細胞復蘇：
1.  從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2.  從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3.  離心， 1 000 rpm，5 min。
4.  棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5.  次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。