分子生物學研究技術：聚合酶鏈式反應（PCR）簡介

1、什么是PCR

PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，其是一種用于放大擴增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學技術。這種技術模擬體內DNA的天然復制過程，能將微量的DNA進行特異性的擴增，在短時間內獲得足夠的DNA，是分子生物學研究中不可缺少的一員。

2、標準PCR的過程

此項技術是模擬DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，在整個PCR過程中包含了變性——退火（復性）——延伸三個基本反應步驟。

• DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
• 退火（復性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
• 延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

3、為什么要使用梯度PCR儀呢

梯度PCR儀是指一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件的儀器，因為不同的DNA片段其最適退火溫度不同，采用梯度PCR儀通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的最適退火溫度，優(yōu)化反應條件，進行有效的擴增。

在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。

使用普通的PCR儀進行擴增時，只能運行一個特定的退火溫度，當目的基因的退火溫度不適時，就可能出現(xiàn)假陽性，影響實驗結果。而對于梯度PCR儀，不但可以作為普通PCR儀使用，也可以通過設置不同的溫度梯度（通常為12個梯度溫度），研究未知DNA退火溫度的擴增，有效降低或避免假陽性，同時在不理想的工作條件下擴增出產(chǎn)物，既節(jié)約成本也提高了實驗效率。

適用于分子生物學、微生物學、遺傳學、細胞生物學、食品科學和農(nóng)學等領域，進行分子克隆、基因表達分析、基因型鑒定、測序、病原微生物分析等實驗研究。