細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)說(shuō)明

細(xì)胞周期是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，使細(xì)胞生長(zhǎng)、遺傳物質(zhì)復(fù)制和細(xì)胞分裂成為可能。從一個(gè)細(xì)胞周期階段到另一個(gè)細(xì)胞周期階段的進(jìn)展是由運(yùn)行在細(xì)胞核中的核心細(xì)胞周期機(jī)制驅(qū)動(dòng)的。這一機(jī)制是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）及其催化部分（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs））組成的。不同的細(xì)胞cyclin-CDK復(fù)合物在細(xì)胞周期的特定階段被激活并磷酸化其靶蛋白。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白的活性受其細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄、蛋白降解以及CDK抑制蛋白的嚴(yán)格控制。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。如下圖：

G0期：這一期的細(xì)胞稱為休眠細(xì)胞，細(xì)胞暫時(shí)脫離分裂周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開始DNA合成, 進(jìn)行細(xì)胞分裂。
G1 期：主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。
S期：這個(gè)時(shí)期主要合成DNA, 同時(shí)還會(huì)合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時(shí)期合成。
G2期：DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。
M期：RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 染色體高度螺旋化。

細(xì)胞周期檢測(cè)的原理：
1、PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法，PI是碘化丙啶(Propidium)，一種雙鏈DNA的熒光染料，碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。
2、通常正常細(xì)胞的G0/ G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細(xì)胞用冰乙醇固定通透后，PI可以與細(xì)胞的DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。
因此，可以通過(guò)流式細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，將細(xì)胞周期區(qū)分為G1/G0 期，S 期和G2/M 期,并可得出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程：
1、收集細(xì)胞：A: 收集細(xì)胞5~20×105于離心管中，若細(xì)胞比較小(如淋巴細(xì)胞)400 g離心，若細(xì)胞比較大(如腫瘤細(xì)胞)300 g離心，5~10 min，棄去培養(yǎng)液;
2、洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次，離心棄去上清;
固定前處理：利用管底殘留的液體，輕彈管底，將沉淀重懸成細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞成團(tuán);
3、細(xì)胞固定：加入約1 ml -20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇中，輕輕吹打混勻，-20℃固定1 h或過(guò)夜;
4、洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次，300 g離心10min，棄去上清;
5、RNA酶消化：300 g 離心 5 min，吸盡上清后，加入 100 μL 的 RNase A 并充分懸浮細(xì)胞，37°C 水浴 30 min。
6、PI染色：加入400μL的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min;
7、上機(jī)檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，低速獲取細(xì)胞，采用分析軟件進(jìn)行DNA含量分析。

細(xì)胞周期檢測(cè)注意事項(xiàng)：
1、培養(yǎng)細(xì)胞注意無(wú)菌環(huán)境。
2、染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護(hù)。
3、本實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)所需收集細(xì)胞量較多，收集細(xì)胞時(shí)盡量多收集一些。
4、本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動(dòng)作輕緩，避免過(guò)多地?fù)p傷細(xì)胞。
5、固定時(shí)必須預(yù)冷PBS重懸打入無(wú)水乙醇中，二者順序不可顛倒。
6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，以對(duì)數(shù)期處理為宜，避免細(xì)胞量過(guò)少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。
7、固定后細(xì)胞雖然可以保存較長(zhǎng)時(shí)間后再上機(jī)檢測(cè)，為避免不可控因素影響最好及早上機(jī)檢測(cè)。