永生化人角質形成細胞HaCaT的培養(yǎng)復蘇和常見問題解答
【細胞介紹】
HaCaT細胞是一種人永生化表皮細胞系，源自一位62歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚組織。這種細胞系在體外培養(yǎng)后自然轉化，獲得了永生化特性，能夠無限期地增殖而不會自然凋亡。HaCaT細胞保留了正常皮膚細胞的特性和功能，表達角蛋白、角化細胞交聯(lián)外膜蛋白以及中間絲相關蛋白，這些蛋白在角質形成和皮膚細胞分化中起著重要的作用。HaCaT細胞因其在體外分化和增殖的高能力而被用于人表皮細胞角化的研究，并解決了培養(yǎng)壽命短和細胞系之間可能遇到的變異等問題。此外，它們也被廣泛應用于皮膚生物學、免疫學、藥物毒性研究、皮膚疾病研究、化妝品和藥物測試等領域。
以下是中喬新舟拍攝的HaCaT細胞拍攝的在不同放大倍數下的圖片：
4X
10X
20X
細胞名稱：Hacat人永生化表皮細胞
細胞別名：HaCAT; HACAT; Hacat
產品貨號：ZQ0044
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)條件：90%DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號：ZM0044
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
1、細胞有脫落情況時，將培養(yǎng)液轉移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細胞（漂浮細胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細胞無變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細胞開始脫落，當達到70-80%細胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細胞充分解離。
3、將細胞懸液轉移到無菌離心管中，計數，離心收集細胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，使細胞密度為每毫升0.6-2X105。將細胞懸液轉至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進行換液。
【細胞凍存】
1、細胞密度80%以上，活細胞百分率達95%以上時，將細胞按照以上步驟進行消化收集細胞沉淀進行凍存。
2、細胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉移至液氮中保存。
【細胞復蘇】
1、液氮取出的細胞放入干冰中轉移至細胞房，提前準備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內容物轉移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內混勻細胞并進行計數。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細胞密度調整至0.6-2.0X105，轉移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當密度達到80%以上時傳代。
【常見問題】
1、細胞貼壁困難
確保培養(yǎng)基預熱至37°C；
使用膠原蛋白涂層的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，以提高細胞貼壁能力；
輕輕吹打細胞懸液，確保細胞均勻分布。
2.細胞增殖速度慢
確保培養(yǎng)基中胎牛血清(FBS)的質量和濃度(10%)；
檢查二氧化碳濃度和培養(yǎng)溫度是否恒定在5%和37°C；
檢查培養(yǎng)基是否新鮮和正確配制，避免使用長時間儲存的培養(yǎng)基。
3、細胞形態(tài)異常:如變圓或收縮
檢查胰蛋白酶消化時間是否過長，適當縮短消化時間；
確保培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分充足；
檢查培養(yǎng)環(huán)境的pH值和滲透壓是否適宜。
4、細胞傳代時死亡率高
避免過度胰蛋白酶消化，使用適量的胰蛋白酶并及時終止消化；
使用溫和的細胞離心速度(150-250g，2-5分鐘)；
傳代時避免細胞過度稀釋，保持適當的細胞密度。
5、細胞內黑點和碎片多
更換新鮮的培養(yǎng)基，避免細胞過度生長導致碎片增加；
傳代時輕輕吹打細胞懸液，避免細胞損傷。
6、培養(yǎng)基中有大量漂浮細胞
檢查細胞是否過度消化或處理不當，調整操作步驟；
定期換液清除漂浮細胞，保證貼壁細胞的健康生長。
【注意事項】
該細胞傳代時需要消化較長時間（5~15分鐘），具體時間因胰酶濃度、效價、消化條件有所不同，請以細胞即將脫落為準。
難消化細胞可采用分步消化：
① 準備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。
【發(fā)表過的文獻】
截至到2024年，引用中喬新舟該細胞發(fā)表過的文獻總數45篇，總的影響因子227.87，最高影響因子27.4數據如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻，可以參考：
1.論文題目：LysSYL-Loaded pH-Switchable Self-Assembling Peptide Hydrogels Promote Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Elimination and Wound Healing
期刊： ADVANCED MATERIALS 影響因子：27.4
2.論文題目：Dynamic Imine Chemistry Enables Paintable Biogel Electrolytes to Shield On-Body Zinc-Ion Batteries from Interfacial Interference
期刊：Journal of the American Chemical Society 影響因子：14.4
3.論文題目：Hydrogel-Based Treatment of House Dust Mite-Induced Atopic Dermatitis through Triple Cleaning of Mites, Bacteria, and ROS-Related Inflammation
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces 影響因子：8.3
4.論文題目：Skin-adaptive film dressing with smart-release of growth factors accelerated diabetic wound healing
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
影響因子：8.025
5.論文題目：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
期刊：BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY 影響因子：7.5
HaCaT細胞是一種人永生化表皮細胞系，源自一位62歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚組織。這種細胞系在體外培養(yǎng)后自然轉化，獲得了永生化特性，能夠無限期地增殖而不會自然凋亡。HaCaT細胞保留了正常皮膚細胞的特性和功能，表達角蛋白、角化細胞交聯(lián)外膜蛋白以及中間絲相關蛋白，這些蛋白在角質形成和皮膚細胞分化中起著重要的作用。HaCaT細胞因其在體外分化和增殖的高能力而被用于人表皮細胞角化的研究，并解決了培養(yǎng)壽命短和細胞系之間可能遇到的變異等問題。此外，它們也被廣泛應用于皮膚生物學、免疫學、藥物毒性研究、皮膚疾病研究、化妝品和藥物測試等領域。
以下是中喬新舟拍攝的HaCaT細胞拍攝的在不同放大倍數下的圖片：
4X
10X
20X
細胞名稱：Hacat人永生化表皮細胞
細胞別名：HaCAT; HACAT; Hacat
產品貨號：ZQ0044
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)條件：90%DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號：ZQ0500）+1%雙抗（中喬新舟 貨號：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號：ZM0044
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
1、細胞有脫落情況時，將培養(yǎng)液轉移到無菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細胞（漂浮細胞少，可能無沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細胞無變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細胞開始脫落，當達到70-80%細胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細胞充分解離。
3、將細胞懸液轉移到無菌離心管中，計數，離心收集細胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，使細胞密度為每毫升0.6-2X105。將細胞懸液轉至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進行換液。
【細胞凍存】
1、細胞密度80%以上，活細胞百分率達95%以上時，將細胞按照以上步驟進行消化收集細胞沉淀進行凍存。
2、細胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉移至液氮中保存。
【細胞復蘇】
1、液氮取出的細胞放入干冰中轉移至細胞房，提前準備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內容物轉移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內混勻細胞并進行計數。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細胞密度調整至0.6-2.0X105，轉移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當密度達到80%以上時傳代。
【常見問題】
1、細胞貼壁困難
確保培養(yǎng)基預熱至37°C；
使用膠原蛋白涂層的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，以提高細胞貼壁能力；
輕輕吹打細胞懸液，確保細胞均勻分布。
2.細胞增殖速度慢
確保培養(yǎng)基中胎牛血清(FBS)的質量和濃度(10%)；
檢查二氧化碳濃度和培養(yǎng)溫度是否恒定在5%和37°C；
檢查培養(yǎng)基是否新鮮和正確配制，避免使用長時間儲存的培養(yǎng)基。
3、細胞形態(tài)異常:如變圓或收縮
檢查胰蛋白酶消化時間是否過長，適當縮短消化時間；
確保培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分充足；
檢查培養(yǎng)環(huán)境的pH值和滲透壓是否適宜。
4、細胞傳代時死亡率高
避免過度胰蛋白酶消化，使用適量的胰蛋白酶并及時終止消化；
使用溫和的細胞離心速度(150-250g，2-5分鐘)；
傳代時避免細胞過度稀釋，保持適當的細胞密度。
5、細胞內黑點和碎片多
更換新鮮的培養(yǎng)基，避免細胞過度生長導致碎片增加；
傳代時輕輕吹打細胞懸液，避免細胞損傷。
6、培養(yǎng)基中有大量漂浮細胞
檢查細胞是否過度消化或處理不當，調整操作步驟；
定期換液清除漂浮細胞，保證貼壁細胞的健康生長。
【注意事項】
該細胞傳代時需要消化較長時間（5~15分鐘），具體時間因胰酶濃度、效價、消化條件有所不同，請以細胞即將脫落為準。
難消化細胞可采用分步消化：
① 準備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基；
② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。
【發(fā)表過的文獻】
截至到2024年，引用中喬新舟該細胞發(fā)表過的文獻總數45篇，總的影響因子227.87，最高影響因子27.4數據如下：
下面列舉了幾篇代表性的文獻，可以參考：
1.論文題目：LysSYL-Loaded pH-Switchable Self-Assembling Peptide Hydrogels Promote Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Elimination and Wound Healing
期刊： ADVANCED MATERIALS 影響因子：27.4
2.論文題目：Dynamic Imine Chemistry Enables Paintable Biogel Electrolytes to Shield On-Body Zinc-Ion Batteries from Interfacial Interference
期刊：Journal of the American Chemical Society 影響因子：14.4
3.論文題目：Hydrogel-Based Treatment of House Dust Mite-Induced Atopic Dermatitis through Triple Cleaning of Mites, Bacteria, and ROS-Related Inflammation
期刊：ACS Applied Materials & Interfaces 影響因子：8.3
4.論文題目：Skin-adaptive film dressing with smart-release of growth factors accelerated diabetic wound healing
期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
影響因子：8.025
5.論文題目：INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
期刊：BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY 影響因子：7.5
