Pipetty在基孔肯雅病毒核酸檢測（蝕斑減少中和試驗）中的應用

方案摘要：本方案主要探討 Pipetty 電動移液器在基孔肯雅病毒核酸（蝕斑減少中和試驗）檢測中的具體應用。這款移液器擁有輕便小巧的特點，重量僅 75g，操作起來十分舒適。同時，它具備高精度的等量連續(xù)分液能力，能夠按照設定的移液量進行多次重復排液，并且配備了溫度控制功能，可避免因手部熱量影響而導致的精度降低。在檢測流程里，無論是樣本稀釋還是連續(xù)加樣等關鍵步驟，該移液器都能發(fā)揮積極作用，有效提高檢測效率與準確性，減少實驗過程中的誤差，為基孔肯雅病毒的檢測工作提供堅實可靠的支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       血清中CHIKV中和抗體可阻斷病毒吸附細胞，而未被中和的病毒仍具有感染細胞的能力，可導致單層細胞病變、脫落等，形成一個局限性的變性細胞區(qū)，該區(qū)稱之為蝕斑。在單層細胞上覆蓋含有活性染料的營養(yǎng)瓊脂可指示蝕斑的多少。“蝕斑”是感染了病毒的細胞，病變死亡后無法被染料染上顏色，形成空斑，而未感染病毒的細胞可被活性染料著色，通過顏色的對比可判定蝕斑量。檢測血清的中和抗體時，需用已知蝕斑滴定度的參考毒株與待檢血清反應，蝕斑數(shù)減少表示血清有中和活性，中和反應后能引起50%蝕斑減少的血清稀釋度的倒數(shù)即為蝕斑減少中和抗體的滴度。蝕斑減少中和試驗檢測基孔肯雅病毒中和抗體實驗應在BSL-3級實驗室內(nèi)進行。
 
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① 4℃冰箱。
② 37℃水浴鍋。
③ 二氧化碳培養(yǎng)箱。
④ 無菌平底6孔組織培養(yǎng)板。
⑤ Pipetty電動移液器MSIC01-02-1000及相應量程吸頭。
 
1、試劑和材料
① 易感細胞：健康單層 Vero 細胞。
② 細胞生長液：100mL生長液中包含 Eagle'sMEM 溶液 88mL，10000IU/mL 青鏈霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1 mL，胎牛血清 10 mL用 7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至 pH 7.2，用前混勻。
③ 細胞維持液：100mL維持液中包含 Eagle'sMEM溶液 96 mL，10 000 U/mL， 青鏈霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至 pH 7.2，用前混勻。
④ 細胞消化液：2.5g胰酶溶于1000mL 無鈣鎂磷酸鹽緩沖液中，過濾除菌。
⑤ 病毒儲備液及其滴定：CHIKV 接種 Vero 細胞，待細胞出現(xiàn)細胞病理性效應(CPE)達+++后收獲病毒，離心后將上清分裝到無菌2mL 螺口血清管，凍存到-70℃冰箱作為病毒儲備液備用。使用前先取一支病毒液進行病毒蝕斑形成單位(PFU)滴定。具體操作步驟為：
（a）準備3塊已長成單層的 VER0細胞6孔細胞培養(yǎng)板，并編號;
（b）將病毒液用維持液做連續(xù) 10 倍稀釋至 10-8，棄去細胞培養(yǎng)液，然后從最高稀釋度起將各稀釋度的病毒液加到 6孔細胞板中，每個稀釋度加兩孔，每孔 100μL，最后兩孔作細胞對照，37℃吸附1h;
（c）準備 1%瓊脂培養(yǎng)基，并使其保溫在 43℃，病毒吸附結(jié)束后加入瓊脂培養(yǎng)基到各細胞孔，每孔 3mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒液完全覆蓋，大約20min后，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入 C02培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)；
（d）每天觀察計數(shù)蝕斑量，并在細胞板的背面用記號筆圈出蝕斑；如果接種 10-4稀釋度的病毒孔的蝕斑無法計數(shù)，接種 10-5稀釋度病毒的兩個細胞孔中平均有 100個蝕斑，那么病毒的滴度為107PFU /mL。
⑥ 其他試劑：陽性對照血清、陰性對照血清、待測血清標本、牛血清白蛋白(BSA)、PH7.4的 Tris緩沖液、瓊脂糖、中性紅。
 
三、實驗步驟
1、待檢血清在 56℃水浴滅活 30 min，除去血清中的補體和其他干擾因子。
2、使用Pipetty電動移液器，設置自動混勻功能，用含 1% BSA 的維持液稀釋病毒至每100μL含有200個蝕斑單位(200 PFU/0.1 mL)。
 
3、使用自動混勻功能，用含 1% BSA 的維持液將待檢血清先做1∶5稀釋，然后做連續(xù)2倍稀釋至 1∶160 或是所需要的滴度，并保證每個稀釋度的工作容量為100μL。
4、取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液100μL，分別加入100μL不同稀釋度的血清中，自動混勻后，4℃孵育過夜，或者 37℃孵育 1h。
 
5、取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液 500μL，加入等量的含1% BSA 的維持液，自動混勻模式，一鍵混勻，然后對病毒液做連續(xù) 10 倍稀釋，包括:10-1 和 10-2，這些混合稀釋液各自的最終病毒含量要達到 100PFU/0.1 mL、10 PFU/0.1 mL 和1 PFU/0.1 mL，最后對病毒液做回滴，并且病毒回滴液和病毒血清混合液在同樣條件下孵育。
6、孵育結(jié)束后，先將6孔板中的單層細胞培養(yǎng)液吸出，然后加入病毒-血清混合液，設置連續(xù)分液功能，每次分液100微升，連續(xù)分液6次，每孔等量加入 100μL。用另外一塊細胞培養(yǎng)板加入用于病毒回滴的病毒稀釋液，各稀釋度加兩孔，37℃吸附1 h。
 
7、準備含中性紅的1%瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，加熱使其完全溶解后放置 43℃水浴使其保持液體狀態(tài)備用，含有中性紅染料的營養(yǎng)瓊脂配方為：維持液中加1%瓊脂和0.4%中性紅。
8、將上述 1%瓊脂培養(yǎng)基逐一加入病毒血清反應孔和病毒回滴孔中，每孔加入3mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒-血清混合液完全覆蓋。
9、大約 20 min 后，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入C02培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。每天觀察計數(shù)蝕斑量，并在倒置的平板上用記號筆圈出蝕斑。
四、結(jié)果判讀
1、病毒回滴試驗是為了確定加入的病毒量是否合適，計算病毒回滴試驗中的蝕斑數(shù)，計算平行孔中的蝕斑數(shù)平均值，只有蝕斑量在 30~100之間時才計算試驗孔中的蝕斑量，最后計算中和抗體滴度。
2、陽性血清對照成立，測定抗體滴度在已知抗體滴度的上下一個稀釋度范圍內(nèi)；同時檢測細胞對照孔，對照孔細胞形態(tài)正常則所做試驗結(jié)果可靠。只有試驗孔出現(xiàn) 90%的蝕斑量減少現(xiàn)象才可判定出現(xiàn)了免疫中和反應。比如，逆滴定表明己知攻擊病毒滴度為 100 PFU/0.1 mL，那么≤10個蝕斑量的血清稀釋度就是終點。
3、能中和病毒的最高血清稀釋度的倒數(shù)就是蝕斑減少中和抗體滴度。