Pipetty在動(dòng)物布魯氏菌病檢測（微量法補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動(dòng)移液器在動(dòng)物布魯氏菌病微量法補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中的應(yīng)用。通過其高精度移液功能，精準(zhǔn)控制抗原、血清、補(bǔ)體等試劑用量，減少人為誤差，降低假陰 / 陽性率，提升檢測準(zhǔn)確性。同時(shí)，利用連續(xù)分液模式，加速 96 孔板批量加樣，效率有效提升，適配基層獸醫(yī)站、海關(guān)等大量樣品檢測場景，為布魯氏菌病防控提供高效可靠的技術(shù)支持。
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方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
布魯氏菌病微量法補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)基于抗原 - 抗體特異性結(jié)合與補(bǔ)體參與的免疫反應(yīng)原理。試驗(yàn)中，布魯氏菌抗原與待檢血清中的特異性抗體結(jié)合，會(huì)固定補(bǔ)體；若血清中無對應(yīng)抗體，補(bǔ)體則與溶血素 - 綿羊紅細(xì)胞復(fù)合物結(jié)合，引發(fā)溶血。通過觀察微量反應(yīng)體系（如 96 孔板）中是否溶血及溶血程度，判斷血清中是否存在布魯氏菌抗體，從而實(shí)現(xiàn)對動(dòng)物感染情況的檢測。該方法利用補(bǔ)體的橋梁作用，將抗原抗體反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可觀察的溶血現(xiàn)象，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 水浴鍋（溫控范圍為 37 ℃~38 ℃和 54 ℃~64 ℃）。
② Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250和滅菌吸頭。
③ 96孔U形聚苯乙烯板。
④ 稀釋用器皿。
 
2、試劑和材料
① 稀釋液：巴比妥緩沖液（1X）或不含巴比妥緩沖液。
② 綿羊紅細(xì)胞懸液，除使用商品化綿羊紅細(xì)胞外。
③ 布魯氏菌陽性對照血清和陰性對照血清。
④ 溶血素，在有效期內(nèi)根據(jù)說明書標(biāo)示效價(jià)使用。
⑤ 補(bǔ)體，每次補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)于當(dāng)日測定補(bǔ)體效價(jià)。優(yōu)先使用商品化凍干補(bǔ)體，也可使用新鮮豚鼠血清作為補(bǔ)體。
⑥ 抗原，在有效期內(nèi)根據(jù)說明書標(biāo)示效價(jià)進(jìn)行使用。
⑦ 溶血標(biāo)準(zhǔn)比色管。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清、抗原、致敏紅細(xì)胞和補(bǔ)體對照。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)各要素添加量和順序見表5，具體操作按以下試驗(yàn)程序：
a） 血清樣品稀釋，96 孔板第 1、2排作為血清抗補(bǔ)體對照，血清稀釋度為 1/2、1/4;從第3排到第8排血清樣品稀釋度分別為 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，按如下步驟操作：
1）使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，在第1排每孔分別加 50μL稀釋液，第 2、4、5、6、7、8排每孔分別加稀釋液 25 μL，丟棄吸頭;
2）在第1排每孔加 50 μL滅能血清，設(shè)置混勻模式，自動(dòng)混勻后吸取 25μL，加入其后的第2排孔，混勻后棄去 25 μL;
3）從第1排孔混勻液體中先后各吸取 25μL，分別加入同列的第3排、第4排孔，混勻;
4）從第4排起倍比稀釋，即從第4排孔吸取液體 25 μL，到同列第5排孔，混勻，以此類推到第8排;
5）第8排孔吸取 25 μL 液體棄去。
b）加抗原，除第1排、第2排外，上述每孔分別加工作量抗原 25 μL。
c）加補(bǔ)體，上述每孔分別加工作濃度補(bǔ)體 25 μL，輕輕混勻，置 4 ℃孵育過夜或 37 ℃孵育 30 min。
d）制備致敏紅細(xì)胞，將 2.5%紅細(xì)胞及溶血素等體積混勻至室溫 20 min。
e）孵育，將孵育過夜的 96 孔板從冰箱取出置 37 ℃孵育 10 min。
f）加致敏紅細(xì)胞，上述每孔加入 50 μL致敏紅細(xì)胞，輕輕混勻，37 ℃孵育 30 min。
g）在室溫條件下1000g離心5min~10 min，或者在 2℃~8 ℃放置 2h~3h讓細(xì)胞自然沉降，觀察判定。
  
四、結(jié)果判定
1、滿足下列條件，試驗(yàn)成立：
陽性血清的抗補(bǔ)體對照、陰性血清對照、陰性血清抗補(bǔ)體對照、抗原對照和補(bǔ)體對照呈完全溶血反應(yīng)，致敏紅細(xì)胞對照是完全抑制溶血反應(yīng)。
2、滿足試驗(yàn)成立條件，將待檢血清孔與溶血標(biāo)準(zhǔn)比色孔進(jìn)行比色，記錄結(jié)果，并按表6，將溶血抑制的百分比換算成標(biāo)準(zhǔn)的國際單位。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢血清的溶血抑制程度>20 IU/mL判為抗體陽性。