高壓冷凍技術(shù)如何提升海洋微生物分析效果

 
甲藻的超微結(jié)構(gòu)分析
環(huán)境樣本（此處以甲藻為例）的超微結(jié)構(gòu)分析至今仍具挑戰(zhàn)性。本研究證明，現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施高壓冷凍（HPF）技術(shù)能顯著保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，為后續(xù)電子顯微鏡（EM）分析提供條件，從而獲得關(guān)于這些海洋生物的新認(rèn)知。
 

1. 通過(guò)手動(dòng)泵抽濾在 1.2 微米混合纖維素酯膜（Merck）上濃縮；
2. 重懸至終體積約 4 毫升；
3. 1000g 離心 5 分鐘。棄上清后，取約 1.2 微升沉淀物裝入預(yù)先涂覆十六烯（Merck）的金銅 A 型載樣臺(tái)（Leica；深 200 微米，寬 3 毫米），覆蓋同樣預(yù)涂十六烯（Merck）的鋁制 B 型載樣臺(tái)（Leica）平面端，使用 Leica EM ICE 進(jìn)行高壓冷凍。

圖 1：高壓冷凍載樣臺(tái)中的濃縮細(xì)胞裝載示意圖
圖 2：A型金載樣臺(tái)（寬 3 毫米，使用面深度為 200 微米）與B型載樣臺(tái)（寬 3 毫米，使用平面?zhèn)龋��?nbsp;  

冷凍固定樣本經(jīng)過(guò)冷凍置換處理（使用 EM AFS2 型號(hào)，Leica 公司），程序及溶液如下：在-90°C 的 2%四氧化鋨丙酮溶液中保持 60 小時(shí)，以 2°C/小時(shí)的速率升溫 15 小時(shí)至-60°C，于-60°C 維持 10 小時(shí)，再以相同速率升溫 15 小時(shí)至-30°C，保持 10 小時(shí)后，以最大速率 1 分鐘內(nèi)升溫至 0°C，停留 1 小時(shí)，隨后以最大速率 1 分鐘內(nèi)冷卻回-30°C，并用純丙酮在-30°C 下洗滌 5 次。 

細(xì)胞隨后逐步滲透 EPON 硬樹脂。采用的樹脂（不含促進(jìn)劑）/丙酮（體積比）梯度系列為：25%濃度起始于-30°C，2 小時(shí)內(nèi)升溫至-10°C；50%濃度起始于-10°C，以 5°C/小時(shí)速率升溫 2 小時(shí)至+10°C；75%濃度起始于+10°C，以 10°C/小時(shí)速率升溫 2 小時(shí)至+20°C。樣本隨后在不含促進(jìn)劑的 100%樹脂中分兩次滲透，分別為 12 小時(shí)和 48 小時(shí)。 

隨后用含促進(jìn)劑的 100%樹脂進(jìn)行兩次 3 小時(shí)和一次過(guò)夜的滲透處理，之后在 60°C 下聚合 48 小時(shí)。使用超薄切片機(jī)（Leica EM UC7）搭配超薄金剛石刀（Diatome）切制 70 納米薄片。薄片經(jīng) 1%醋酸鈾水溶液染色 20 分鐘和檸檬酸鉛染色 3 分鐘后進(jìn)行后染色。通過(guò) SerialEM 軟件在 JEOL JEM 2100plus 電鏡上以 120 千伏電壓和 8000 倍放大倍數(shù)采集拼圖影像。拼圖處理采用 Imod 和 Fiji 軟件完成。高壓冷凍樣本處理由海德堡 EMBL 電子核心顯微設(shè)施（EMCF）完成。