從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測(cè)器和測(cè)量技術(shù)（上）

為什么混合探測(cè)器允許在更高強(qiáng)度下進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，以及為什么直方圖有時(shí)看起來(lái)會(huì)很奇怪

本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測(cè)器。“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對(duì)單點(diǎn)進(jìn)行激發(fā)和測(cè)量的技術(shù)。本文旨在為用戶提供不同技術(shù)之間清晰的概覽，并針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景給出合適的檢測(cè)器選擇建議，而非深入探討專業(yè)細(xì)節(jié)。

介紹
首先，本文將簡(jiǎn)要介紹光電倍增管（PMT）。在闡述光信號(hào)如何轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討檢測(cè)器捕獲電信號(hào)的不同方法。這些方法基本適用于所有檢測(cè)器，但轉(zhuǎn)換技術(shù)的適用性會(huì)因檢測(cè)器類型而異。
最后，本文將介紹兩種近年來(lái)出現(xiàn)的、部分或全部采用半導(dǎo)體技術(shù)的檢測(cè)器：雪崩光電二極管（APD）和混合探測(cè)器（HyD）。

光電倍增管
這項(xiàng)經(jīng)典技術(shù)利用外光電效應(yīng)，本文將首先對(duì)此進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。這將有助于理解為何不同材料用于不同目的。增益的產(chǎn)生是通過(guò)產(chǎn)生次級(jí)電子，然后在多個(gè)階段對(duì)其進(jìn)行再次放大。放大過(guò)程發(fā)生在所謂的倍增極（dynode）上。最后，產(chǎn)生的眾多電子需要釋放到外部電路，這項(xiàng)工作由陽(yáng)極完成。
將光子轉(zhuǎn)化為電子（陰極）
外光電效應(yīng)描述的是光照射（最初為金屬）表面時(shí)，表面產(chǎn)生自由電子的現(xiàn)象。最早被觀察到的光電效應(yīng)是“貝克勒爾效應(yīng)”，即當(dāng)浸在導(dǎo)電液體中的電極受到不同強(qiáng)度的光照射時(shí)，電極間會(huì)產(chǎn)生電勢(shì)差[1]。這種效應(yīng)類似于半導(dǎo)體中觀察到的效應(yīng)，現(xiàn)在通常被稱為“光伏效應(yīng)”，也是推動(dòng)家用屋頂太陽(yáng)能電池板產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的原因。該技術(shù)中不產(chǎn)生自由電子，因此被稱為“內(nèi)光電效應(yīng)”。內(nèi)光電效應(yīng)對(duì)“雪崩光電二極管”一章中描述的雪崩光電二極管至關(guān)重要。
海因里希·赫茲[2]觀察并描述了外光電效應(yīng)，他發(fā)現(xiàn)紫外光對(duì)他的火花間隙（“Tele-Funken”）的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。威廉·哈瓦克斯[3]繼續(xù)研究了光致電現(xiàn)象，這也是外光電效應(yīng)一度被稱為哈瓦克斯效應(yīng)的原因。阿爾伯特·愛(ài)因斯坦[4]理解并解釋了這些測(cè)量現(xiàn)象。通過(guò)復(fù)興牛頓的光的粒子理論[5]，他成功解釋了所有無(wú)法用波動(dòng)理論推導(dǎo)出的觀察結(jié)果。
圖1：外部（左）和內(nèi)部（右）光電效應(yīng)示意圖。在外光電效應(yīng)中，材料（例如堿金屬）吸收光量子后釋放出一個(gè)電子，然后該電子可以被電場(chǎng)加速（例如在真空中）。在內(nèi)光電效應(yīng)中，光子被吸收后產(chǎn)生一對(duì)電荷（電子/空穴）。這些電荷也可以在半導(dǎo)體材料中被加速。
測(cè)量照射到單個(gè)電極時(shí)釋放的電子數(shù)量（即通過(guò)第二個(gè)電極檢測(cè)到的電流），我們發(fā)現(xiàn)該數(shù)量與光的強(qiáng)度成正比。這與光的波動(dòng)理論相符：電場(chǎng)強(qiáng)度越大，用于釋放電子的能量就越多。然而，考察這些電子的動(dòng)能（即“初始速度”）時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)該速度并不取決于光的強(qiáng)度，而僅取決于光的波長(zhǎng)。此外，存在一個(gè)最大波長(zhǎng)，超過(guò)該波長(zhǎng)則不會(huì)再有電子釋放。這個(gè)最大波長(zhǎng)是陰極材料的固有屬性。這與波動(dòng)理論的觀點(diǎn)相悖，后者認(rèn)為只要提供足夠的能量——對(duì)于弱光強(qiáng)度的情況，只需照射更長(zhǎng)時(shí)間——就能夠激發(fā)接收器釋放電子。
圖2：光電子的動(dòng)能（紅色）和光子能量（藍(lán)色）隨波長(zhǎng)變化的曲線。圖中數(shù)據(jù)適用于鋅光電陰極。如果光子能量小于功函數(shù)，則不會(huì)釋放光電子（能量保持為零）。如果光子能量高于功函數(shù)，則光電子將獲得超出功函數(shù)部分的能量作為動(dòng)能，并且該電子可以在真空中進(jìn)一步加速。
這種現(xiàn)象可以通過(guò)將光理解為粒子來(lái)解釋：在1900年，馬克斯·普朗克引入了“作用量子”的概念，以描述溫度和輻射能量之間的正確關(guān)系[6]之后，愛(ài)因斯坦將這種量子化概念應(yīng)用于光能量本身。因此，光被劃分為大小為E=h*c/λ的能量包，其中h是普朗克常數(shù)。如果一個(gè)具有特定能量E的光粒子撞擊金屬表面，該能量可以被吸收，并可以將一個(gè)電子從陰極材料的結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)。然而，要發(fā)生這種情況，光子必須至少具有與將電子束縛在材料中的能量相同的能量。這就是上述由功函數(shù)WA描述的最小能量。能量較低的光粒子無(wú)法釋放任何電子，無(wú)論單位時(shí)間內(nèi)有多少光粒子撞擊表面（即強(qiáng)度）。由于c和h是物理常數(shù)，光子能量?jī)H取決于波長(zhǎng)λ，實(shí)際上與波長(zhǎng)成反比。當(dāng)波長(zhǎng)超過(guò)某個(gè)值λmin時(shí)，光子的能量E=c/λmin將小于功函數(shù)，此時(shí)測(cè)量?jī)x器將不會(huì)顯示任何電流。
波長(zhǎng)較短的光子能夠釋放電子，并且我們發(fā)現(xiàn)這些電子的動(dòng)能與波長(zhǎng)呈線性關(guān)系，其表達(dá)式為：Ekin = h*c/λ – WA，但與輻射強(qiáng)度（光子密度）無(wú)關(guān)。在較高輻射強(qiáng)度下，最初的變化僅是產(chǎn)生更多的自由電子。
圖2展示了鋅的這一關(guān)系。從圖中可以看出，要檢測(cè)到光電效應(yīng)，光的波長(zhǎng)至少要短于約280納米。因此，鋅陰極不適用于可見光。所用材料的功函數(shù)應(yīng)盡可能低。從元素周期表可以看出，堿金屬尤其適用，因?yàn)樗鼈兊淖钔鈱与娮优c原子核的結(jié)合非常弱。因此，光電陰極的有效成分通常是堿金屬或其混合物（例如Cs、Rb、K、Na）。為了在可見光范圍內(nèi)獲得良好的效果，現(xiàn)在也經(jīng)常在光電陰極材料中使用半導(dǎo)體晶體（例如GaAsP）。更多細(xì)節(jié)可在濱松光電倍增管手冊(cè)[7]中找到。這也適用于以下所有章節(jié)，尤其是關(guān)于光電倍增管特性的部分。
選擇檢測(cè)器的關(guān)鍵參數(shù)是光電陰極的量子效率，即入射光子數(shù)與產(chǎn)生的光電子數(shù)之比。堿金屬光電陰極在300納米至600納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)表現(xiàn)良好，在光譜的藍(lán)色區(qū)域可達(dá)到接近30%的效率。半導(dǎo)體變體的效率可高達(dá)50%，可在400納米至700納米（GaAsP）或900納米（GaAs）波長(zhǎng)范圍內(nèi)使用。因此，半導(dǎo)體光電陰極越來(lái)越多地用于需要較長(zhǎng)波長(zhǎng)的生命科學(xué)應(yīng)用，因?yàn)楣鈱W(xué)散射是厚樣品的主要問(wèn)題，且散射程度隨波長(zhǎng)的四次方遞減。
由于應(yīng)用的多樣性，存在大量在光譜靈敏度、量子效率和時(shí)間分辨率方面各不相同的光電陰極類型。

乘法（動(dòng)態(tài)電極）
在光電陰極中，每個(gè)入射并有效的光子會(huì)釋放出一個(gè)電子。當(dāng)然，測(cè)量單個(gè)光電子的難度與測(cè)量單個(gè)光子相當(dāng)。然而，與光子不同的是，電子極易操控：可以通過(guò)直流電壓來(lái)增加電子的能量。如果自由電子在放電前通過(guò)電壓U，它將吸收能量e*U，該能量以動(dòng)能的形式添加到電子上（在真空管中）。例如，在1000伏的電勢(shì)差下，電子將獲得1000電子伏特（eV）的動(dòng)能。一個(gè)620納米的光子大約具有2 eV的能量。由此可見，通過(guò)高電壓加速光電子，可以使“單光子”信號(hào)獲得遠(yuǎn)高于光子本身能量的能量：這就是信號(hào)增益。
圖3：光電倍增管（PMT）的設(shè)計(jì)和功能示意圖。光子（綠色箭頭）在光電陰極（黃色）處被吸收，觸發(fā)光電子的釋放（藍(lán)色）。在級(jí)聯(lián)放大器的倍增極（此處為6個(gè)倍增極）上，動(dòng)能被轉(zhuǎn)換為多個(gè)自由電子（倍增）。在管的末端，產(chǎn)生的電荷在陽(yáng)極（黃色）處被測(cè)量。
在經(jīng)典PMT中，這種增益分布在多個(gè)級(jí)之間。在光電陰極后面是一個(gè)帶有正電壓的電極，其典型電壓介于50伏和100伏之間。釋放的光電子被該正電位吸引，并沿該方向加速，直到最終撞擊該電極。在此，動(dòng)能被轉(zhuǎn)換為釋放更多電子（“次級(jí)電子”）——這與光電陰極吸收光子后發(fā)生的過(guò)程非常相似。典型值為每個(gè)入射電子產(chǎn)生2-4個(gè)次級(jí)電子。
為了產(chǎn)生可測(cè)量的電荷，該過(guò)程需要在級(jí)聯(lián)結(jié)構(gòu)中重復(fù)多次，例如，如果每個(gè)電極（此處稱為倍增極）產(chǎn)生3個(gè)次級(jí)電子，則總共會(huì)釋放3k個(gè)電子，其中k代表倍增極的數(shù)量。典型的PMT大約有10個(gè)倍增極，這相當(dāng)于3^10 = 59,049個(gè)電子——一個(gè)可測(cè)量的電荷約為10 fC。
光電倍增管的整體增益可以通過(guò)總高壓進(jìn)行控制，該高壓通常通過(guò)分壓器在各個(gè)倍增極之間進(jìn)行均勻分配。電壓越高，增益越大。每個(gè)倍增極釋放的電子數(shù)是一個(gè)平均值，可以通過(guò)電壓進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。這就是為什么會(huì)出現(xiàn)諸如“2.7個(gè)釋放電子”這樣看似奇怪的數(shù)值。
圖4：平均增益為2.7倍時(shí)，光電倍增管倍增極釋放次級(jí)電子的概率分布。最常見的情況是釋放2個(gè)或3個(gè)電子，但也可能釋放8個(gè)甚至0個(gè)電子。由于這些事件在級(jí)聯(lián)的倍增極上連續(xù)發(fā)生，因此鏈末端的脈沖分布并不像x軸上的整數(shù)那樣離散。相反，幾乎所有中間值都會(huì)被記錄（紅色曲線），從而形成一種準(zhǔn)連續(xù)性。然而，這條曲線并非意味著性能更優(yōu)，它只是極高噪聲的結(jié)果。
圖4展示了以2.7個(gè)電子為例的頻率分布，描述了到達(dá)倍增極的電子實(shí)際釋放的電子數(shù)量。大多數(shù)情況下，會(huì)釋放1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)電子，偶爾甚至更多。在“后期”倍增極，每次前一級(jí)倍增極的電子倍增到達(dá)時(shí)，這些事件都會(huì)被平均化，每個(gè)脈沖獲得約2.7倍的增益。然而，由于只有一個(gè)電子到達(dá)第一個(gè)倍增極，因此無(wú)法在第一個(gè)倍增極上取平均值。因此，圖4中的分布是PMT末端脈沖高度分布的近似值，表明該值波動(dòng)范圍為4到5倍。因此，每個(gè)光子的增益量變化很大。這是積分測(cè)量方法中噪聲的重要來(lái)源（見下文）。這些不同的脈沖高度也會(huì)導(dǎo)致光子計(jì)數(shù)時(shí)的分辨問(wèn)題。
電子也可能無(wú)法擊中目標(biāo)（下一個(gè)電極）。發(fā)生這種情況的階段不同，總電荷的精度會(huì)降低，效率也會(huì)下降。因此，通常使用“探測(cè)效率”一詞，而不是光電陰極的“量子效率”，因?yàn)樗�考慮了整個(gè)電子倍增鏈中的損耗。

信號(hào)（陽(yáng)極）
在高壓倍增級(jí)放大后，電子最終到達(dá)陽(yáng)極，在那里可以測(cè)量電荷。由于電子在管內(nèi)可能采取不同的路徑，它們并非同時(shí)到達(dá)陽(yáng)極。因此，電子到達(dá)的時(shí)間也呈一定分布，這種時(shí)間分布反映在理想電脈沖的寬度上。實(shí)際上，脈沖形狀很大程度上受測(cè)量裝置的影響，測(cè)得的脈沖寬度是到達(dá)電荷分布與下游電子設(shè)備衰減特性的卷積結(jié)果。
圖5：PMT陽(yáng)極的電荷脈沖形狀。吸收光子（綠色箭頭）后，電荷會(huì)在一定時(shí)間后迅速增加，然后以較慢的速率下降。光子到達(dá)與脈沖峰值之間的時(shí)間稱為渡越時(shí)間（TT）。脈沖寬度用半峰全寬（FWHM）表示。   
為了描述脈沖形狀，通常使用半峰全寬（FWHM）。對(duì)于PMT，F(xiàn)WHM大致在5到25納秒之間。當(dāng)然，脈沖在陽(yáng)極的有效時(shí)間比FWHM要長(zhǎng)，對(duì)于10%上升沿到90%下降沿之間的時(shí)間，我們可以粗略地估計(jì)為FWHM的兩倍。然而，脈沖形狀是不對(duì)稱的；上升時(shí)間比下降時(shí)間快兩到三倍�？梢酝ㄋ椎貙⑵浔茸鞴废丛韬笏Φ羯砩系乃�滴：水滴數(shù)量先迅速增加，然后逐漸減少——因?yàn)槭Ｏ碌乃�滴越�?lái)越少。
光子到達(dá)陰極與輸出脈沖峰值之間的時(shí)間稱為渡越時(shí)間（TT），其值約為15到70納秒，具體取決于光電管的設(shè)計(jì)。這是信號(hào)在管內(nèi)傳輸?shù)臅r(shí)間。渡越時(shí)間也在一個(gè)平均值附近隨機(jī)分布，渡越時(shí)間擴(kuò)展（TTS）為1–10納秒。這是熒光壽命應(yīng)用的重要參數(shù)，因?yàn)樗�限制了測(cè)量的準(zhǔn)確性。
即使沒(méi)有光子照射到陰極，陽(yáng)極仍然會(huì)以一定的頻率檢測(cè)到事件。這些事件大多由陰極發(fā)射的熱電子觸發(fā)。來(lái)自倍增極的熱電子也可能導(dǎo)致一些較小的事件。這些事件被歸類為“暗噪聲”，會(huì)降低圖像對(duì)比度，對(duì)于微弱信號(hào)而言，這是一個(gè)尤其嚴(yán)重的問(wèn)題，因?yàn)檫@些信號(hào)可能無(wú)法與背景區(qū)分開來(lái)。在PMT中，光電陰極和早期倍增極的噪聲會(huì)被后續(xù)的倍增級(jí)放大。而單級(jí)系統(tǒng)中則不存在這種情況。因此，雙級(jí)混合探測(cè)器（見“混合探測(cè)器”一章）產(chǎn)生的倍增噪聲要小得多。

參考文獻(xiàn)：
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