從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測(cè)器和測(cè)量技術(shù)（中）

本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測(cè)器。“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對(duì)單點(diǎn)進(jìn)行激發(fā)和測(cè)量的技術(shù)。本文旨在為用戶提供不同技術(shù)之間清晰的概覽，并針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景給出合適的檢測(cè)器選擇建議，而非深入探討專(zhuān)業(yè)細(xì)節(jié)。

測(cè)量方法和直方圖
到達(dá)陽(yáng)極的電荷云會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電壓脈沖。更準(zhǔn)確地說(shuō)，施加在高壓上的正電位會(huì)被到達(dá)的負(fù)電荷以脈沖形式略微衰減。此時(shí)的電荷是可測(cè)量的，但仍然非常微弱。因此，需要進(jìn)行仔細(xì)的設(shè)計(jì)以確保獲得有意義的測(cè)量結(jié)果�；�本上，有三種不同的測(cè)量概念，將在下文概述。這些概念適用于所有類(lèi)型的檢測(cè)器，包括“雪崩光電二極管”和“混合探測(cè)器”章節(jié)中描述的雪崩光電二極管和混合探測(cè)器。然而，這些方法并非對(duì)所有檢測(cè)器都同樣適用。

我們?cè)诖艘蚕胩接懸幌略u(píng)估方法，因?yàn)橛脩襞c其說(shuō)是對(duì)檢測(cè)器的工作原理感興趣，不如說(shuō)是更關(guān)心這些信號(hào)對(duì)其測(cè)量和研究的意義。

電荷放大器
圖6：檢測(cè)器S在吸收一個(gè)光量子hν后產(chǎn)生電荷Q。該電荷由一個(gè)運(yùn)算放大器進(jìn)行累加。運(yùn)算放大器（OP）確保其反相輸入端（–）的電壓始終等于同相輸入端（+）的電壓。因此，當(dāng)來(lái)自PMT陽(yáng)極的電荷到達(dá)時(shí)，會(huì)立即通過(guò)對(duì)電容器C充電來(lái)進(jìn)行補(bǔ)償（紅色圓圈）。然后，電容器上的電荷對(duì)應(yīng)于在整個(gè)測(cè)量時(shí)間內(nèi)到達(dá)的電荷，輸出電壓Ua與C成正比，因此可以進(jìn)行測(cè)量。在一個(gè)像素的測(cè)量結(jié)束后，系統(tǒng)會(huì)被重置為零。
測(cè)量PMT信號(hào)的傳統(tǒng)技術(shù)是使用所謂的電荷放大器。在掃描顯微鏡中，激發(fā)光束持續(xù)掃描樣品，每條掃描線都需要?jiǎng)澐譃樗�需�?shù)量的像素。對(duì)于經(jīng)典的結(jié)構(gòu)圖像，典型的記錄時(shí)間約為一秒，每幅圖像包含1000條掃描線，每條線包含1000個(gè)像素。因此，每個(gè)像素的記錄時(shí)間約為1微秒。在這1微秒內(nèi)，來(lái)自PMT的所有電荷都會(huì)在電容器中累積，如圖7所示�？倳r(shí)間的一部分會(huì)用于重置電荷放大器，以便其在下一個(gè)像素的測(cè)量時(shí)重新從零開(kāi)始。最終得到一個(gè)與從PMT接收的總電荷成正比的電壓。然后，該電壓通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC）轉(zhuǎn)換為“灰度值”。通常使用8位分辨率，即灰度值是介于0和255之間的整數(shù)。通過(guò)調(diào)節(jié)PMT的高壓，可以確保測(cè)得的信號(hào)“落入”這8位范圍內(nèi)，即充分利用整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍，而不會(huì)因過(guò)載而導(dǎo)致信號(hào)截?cái)唷?br /> 圖7：使用電荷放大器進(jìn)行測(cè)量時(shí)，在一個(gè)像素的時(shí)間段內(nèi)，電荷脈沖（藍(lán)色）和積分信號(hào)（紅色）的變化。亮度讀數(shù)是最終的積分值。然后在重置階段對(duì)電容器進(jìn)行放電，以便開(kāi)始下一個(gè)像素的測(cè)量。
顯然，這些灰度值并不代表絕對(duì)亮度值，而只能用于比較不同圖像區(qū)域的相對(duì)亮度，或者比較在相同測(cè)量設(shè)置下采集的圖像的亮度。如上所述，每個(gè)入射光子的信號(hào)強(qiáng)度變化很大。在一個(gè)圖像元素的亮度測(cè)量時(shí)間內(nèi)，會(huì)有若干甚至許多光子入射�？赡艿娜≈凳菃蝹�(gè)光子電荷的所有組合，這些組合本身就是準(zhǔn)連續(xù)變化的。因此，累積測(cè)量中的光子事件完全模糊，信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)連續(xù)分布。數(shù)字化過(guò)程則將這種連續(xù)分布轉(zhuǎn)換為256個(gè)離散的亮度值，即灰度值。
圖8：植物根莖切片的雙通道圖像。感興趣區(qū)域用黃線標(biāo)出。大部分區(qū)域是黑色背景，在直方圖的左側(cè)區(qū)域，即低灰度值區(qū)域，表現(xiàn)為非常高的峰值。為了使實(shí)際信號(hào)的直方圖清晰可見(jiàn)，計(jì)數(shù)被限制為僅顯示非背景結(jié)果。紅色通道的信號(hào)是紅色直方圖中的肩部（介于80和200灰度值之間）。
當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)人員通常并不關(guān)注單個(gè)圖像元素的亮度，而是關(guān)注諸如完整細(xì)胞或組織成分等結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。因此，他們會(huì)選擇一個(gè)感興趣區(qū)域（ROI）并獲取其亮度值。根據(jù)圖像分辨率（通常約為1000 x 1000像素，即1百萬(wàn)像素），數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)圖像元素會(huì)被組合成一個(gè)單一的數(shù)值。然后，可以將該平均值與其他結(jié)構(gòu)的值進(jìn)行比較，或者在活體材料實(shí)驗(yàn)中將其繪制為時(shí)間變化曲線等。例如，還可以更精確地分析該區(qū)域內(nèi)的亮度分布。為此，需要生成一個(gè)直方圖，統(tǒng)計(jì)具有特定亮度的圖像元素?cái)?shù)量。由于有256種不同的亮度級(jí)別，因此在8位直方圖的x軸上會(huì)顯示從0到255的數(shù)字。由于數(shù)字化過(guò)程，這里不存在中間值。因此，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，直方圖中不應(yīng)存在連續(xù)的線條。此外，y軸上繪制的頻率也只能是整數(shù)，這很合理，因?yàn)樗鼈兇�表圖像元素的數(shù)量。圖8展示了一個(gè)此類(lèi)直方圖。我們可以從該直方圖中提取各種細(xì)節(jié)；這里我們主要關(guān)注三個(gè)屬性。
如果亮度分布是對(duì)稱(chēng)的，則平均亮度值位于直方圖的最大值處。然而，我們經(jīng)常會(huì)觀察到某種程度的不對(duì)稱(chēng)性，表明平均值略微偏離最大值，可能偏左或偏右。
對(duì)于極端的亮度波動(dòng)，曲線會(huì)變得非常“寬”。如果沒(méi)有方差，則只會(huì)有一個(gè)灰度值，“曲線”將無(wú)限窄。因此，寬度是方差的體現(xiàn)。然而，影響這種方差的因素不僅是每次測(cè)量時(shí)間內(nèi)到達(dá)圖像元素的 photons 數(shù)量分布，還包括測(cè)量系統(tǒng)的噪聲特性，尤其是PMT以及電子設(shè)備的噪聲。只有當(dāng)這些噪聲部分足夠小時(shí)，才有可能根據(jù)平均值與寬度的比率來(lái)估計(jì) contributing photons 的數(shù)量。
由于零點(diǎn)由電子設(shè)備的設(shè)置固定，因此無(wú)法從灰度值直方圖中推斷出背景亮度中PMT暗電流的比例。
為了獲得可用的圖像，需要大約為3的信噪比（SNR）。當(dāng)在圖像元素中記錄到10個(gè)光子時(shí)，即可達(dá)到此信噪比。對(duì)于線頻為1 kHz的1百萬(wàn)像素圖像，這意味著每秒有1000萬(wàn)個(gè)光子入射。然而，通常我們會(huì)盡量使用較弱的光照，因?yàn)楦邚?qiáng)度激發(fā)會(huì)破壞熒光染料，且產(chǎn)生的分解產(chǎn)物通常對(duì)生物體有害。因此，需要降低激發(fā)強(qiáng)度，以在圖像質(zhì)量和樣本穩(wěn)定性之間取得平衡。因此，每個(gè)像素通常只記錄到平均1到3個(gè)甚至更少的光子。即使信號(hào)極其微弱，只要每個(gè)像素的平均光子數(shù)遠(yuǎn)小于1，仍然可以進(jìn)行有效的評(píng)估。
為什么即使只有10個(gè)光子，我們也能獲得遠(yuǎn)超過(guò)200種不同的灰度值？15種不同的亮度級(jí)別難道不夠嗎？如果每個(gè)光子在圖像中產(chǎn)生相同的信號(hào)，那么15級(jí)就足夠了。但是，正如我們上面所述，脈沖高度變化很大（強(qiáng)度存在噪聲）。如果一個(gè)像素中累加了多個(gè)光子的脈沖，則可能的亮度值數(shù)量會(huì)再次增加。這就是亮度級(jí)別數(shù)量龐大的原因。而且，使用的級(jí)別越多（例如使用約12或16位的較低灰度分辨率），我們就越會(huì)放大脈沖變化產(chǎn)生的噪聲。然而，這樣做并不能提供更好的信息。
圖9：上圖：如果圖像中只使用了少量灰度級(jí)，則直方圖僅在狹窄的范圍內(nèi)顯示數(shù)值。下圖：如果將這些灰度級(jí)乘以一個(gè)系數(shù)，以充分利用8位動(dòng)態(tài)范圍（例如，為了使顯示器上的圖像更易于觀察），則灰度級(jí)的數(shù)量保持不變，中間的級(jí)別仍然為空，從而導(dǎo)致直方圖中出現(xiàn)“間隙”。

直方圖還提供其他有用的信息。如果在記錄過(guò)程中沒(méi)有充分利用0到255的完整動(dòng)態(tài)范圍，而只使用了底部十分之一（0到25），則顯示器上的圖像會(huì)非常暗，因?yàn)轱@示器只使用了0到25的灰度值。我們只能通過(guò)“擴(kuò)展”直方圖來(lái)使圖像變亮，這是當(dāng)今所有數(shù)碼相機(jī)都自動(dòng)提供的常用技術(shù)。這種方法是將每個(gè)像素的亮度值乘以相同的系數(shù)Z。在上述情況下，我們需要將所有值乘以10，以覆蓋0到255的范圍。然而，由于最初只有25個(gè)不同的值，因此最終圖像中也只有25個(gè)不同的值。因此，直方圖會(huì)出現(xiàn)間隙；在我們的示例中，所有繪制的灰度值之間都缺少9個(gè)值。因此，圖表看起來(lái)有些“雜亂”，但數(shù)據(jù)是正確的。
雖然電荷放大器多年來(lái)一直用作共聚焦顯微鏡上測(cè)量PMT信號(hào)的設(shè)備，但它現(xiàn)在已基本被其他技術(shù)取代（見(jiàn)下文）。電荷放大器提供的信號(hào)是對(duì)整個(gè)像素時(shí)間內(nèi)的信號(hào)進(jìn)行積分，因此結(jié)果取決于像素時(shí)間的長(zhǎng)度。然而，如果改變掃描格式（例如，在相同的掃描速度下，每行只記錄100個(gè)而不是1000個(gè)像素），則像素時(shí)間會(huì)發(fā)生變化。此時(shí)信號(hào)會(huì)增大10倍，因此需要調(diào)整PMT上的高壓。改變掃描速度也會(huì)產(chǎn)生相同的效果。此外，由于電荷放大器的復(fù)位需要一定的時(shí)間，因此每個(gè)像素的測(cè)量時(shí)間都會(huì)損失一部分。在高掃描速度和高分辨率下，像素時(shí)間非常短，復(fù)位造成的損失會(huì)變得顯著。直接數(shù)字化可以解決這個(gè)問(wèn)題。

直接數(shù)字化
圖10：與圖7中相同的光子事件。與高保真技術(shù)類(lèi)似，PMT輸出端的信號(hào)以高頻率直接數(shù)字化（紅色星號(hào)）。數(shù)字化頻率（采樣時(shí)鐘）設(shè)置得足夠高，以高于測(cè)量系統(tǒng)的電子帶寬（“過(guò)采樣”），從而確保信號(hào)被完整捕獲。

現(xiàn)代數(shù)字化電路的速度足夠快，能夠直接將PMT信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字量。具體方法是通過(guò)一個(gè)適當(dāng)阻值的電阻對(duì)PMT產(chǎn)生的電荷進(jìn)行放電，并以高時(shí)鐘頻率將由此產(chǎn)生的電壓轉(zhuǎn)換為灰度值。單個(gè)圖像元素的數(shù)據(jù)在記錄過(guò)程中會(huì)立即進(jìn)行平均，因此，無(wú)論記錄一個(gè)圖像元素需要多長(zhǎng)時(shí)間，圖像最終獲得的灰度值都能真實(shí)地反映樣本的強(qiáng)度。采用這種方法，無(wú)需重新調(diào)整PMT的高壓，可以直接比較亮度值。此外，也不存在因復(fù)位而造成的時(shí)間損失。
使用直接數(shù)字化方法獲得的直方圖與使用電荷放大器時(shí)獲得的直方圖看起來(lái)完全相同，并且基本上包含相同的信息。這是因?yàn)槠骄�方法本質(zhì)上也是對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行累加，只不過(guò)是立即在正確的時(shí)間軸上進(jìn)行縮放。掃描變焦也不會(huì)改變圖像亮度，除非是由于不同程度的熒光染料漂白等原因造成的真實(shí)亮度變化——但這屬于有價(jià)值的信息，而不是測(cè)量偽影。漂白現(xiàn)象也可以通過(guò)這種方法立即進(jìn)行量化。
這項(xiàng)技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不存在因清空存儲(chǔ)器而造成的死時(shí)間。這使得在極短的像素時(shí)間內(nèi)能夠獲得更好的信噪比。

光子計(jì)數(shù)
我們現(xiàn)在可以使用清晰簡(jiǎn)潔的直方圖來(lái)描述強(qiáng)度。然而，有趣的是，世界遠(yuǎn)非如此平滑和連續(xù)。正如馬克斯·普朗克[7]無(wú)意中發(fā)現(xiàn)的那樣，光并非以連續(xù)強(qiáng)度的形式存在。因此，我們的探測(cè)器測(cè)量的是單個(gè)事件——光子的到達(dá)，而不是連續(xù)的強(qiáng)度值。表面上的連續(xù)性是測(cè)量上的模糊性造成的：PMT模擬測(cè)量的直方圖顯示的是模糊測(cè)量的合并結(jié)果。正如我們已經(jīng)提到的，PMT接收到的每個(gè)光子都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)寬度變化的脈沖，其強(qiáng)度先上升后下降。通過(guò)對(duì)大量寬度和高度不同的脈沖進(jìn)行積分或平均，可以獲得一個(gè)看似連續(xù)的亮度直方圖，其中可以出現(xiàn)任何強(qiáng)度值。此外，這些強(qiáng)度值的數(shù)量取決于數(shù)據(jù)記錄中人為設(shè)定的“灰度深度”。然而，事實(shí)并非如此。仔細(xì)考慮后會(huì)發(fā)現(xiàn)，像素中的亮度不能用有理數(shù)表示。它只能是一個(gè)整數(shù)，事實(shí)上，它只能是在該像素的測(cè)量時(shí)間內(nèi)到達(dá)探測(cè)器的光子確切數(shù)量。因此，與其對(duì)每個(gè)脈沖的電荷（即脈沖曲線下的面積）進(jìn)行積分或平均，不如直接計(jì)數(shù)到達(dá)陽(yáng)極的電荷脈沖，而不評(píng)估脈沖大小。這將解決大部分噪聲問(wèn)題。
* 事實(shí)上，光強(qiáng)也取決于光子的顏色，這會(huì)對(duì)脈沖高度產(chǎn)生輕微影響。然而，這種能量差異在整個(gè)光譜范圍內(nèi)僅約為2電子伏特。與第一個(gè)倍增極上約80伏特的電壓相比，這可以忽略不計(jì)。對(duì)于下文將討論的混合探測(cè)器（HyD），這種變化甚至要小一百倍左右。
光電子的初始速度也存在類(lèi)似情況，正如我們之前提到的，光電子可以從陰極向任何方向發(fā)射。一些光電子會(huì)朝著期望的方向運(yùn)動(dòng)，而另一些則需要通過(guò)改變方向來(lái)加速，這會(huì)導(dǎo)致它們撞擊倍增極時(shí)的動(dòng)能有所損失。這種動(dòng)能的變化范圍也在±2電子伏特左右。
圖11：與圖7和圖10中相同的光子事件。對(duì)單個(gè)光子產(chǎn)生的電荷脈沖進(jìn)行計(jì)數(shù)稱(chēng)為“光子計(jì)數(shù)”。雖然這項(xiàng)技術(shù)產(chǎn)生的噪聲遠(yuǎn)低于電荷放大，但它只能應(yīng)用于高度相似且不會(huì)相互重疊的脈沖。此外，較小的脈沖可能無(wú)法被識(shí)別。

如今，這種計(jì)數(shù)器在電子學(xué)中已成為標(biāo)準(zhǔn)配置。脈沖的高度或斜率用于激活一個(gè)觸發(fā)器，每次觸發(fā)計(jì)數(shù)器值加1。在一個(gè)像素的測(cè)量結(jié)束時(shí)，計(jì)數(shù)器會(huì)被重置為0（這個(gè)過(guò)程幾乎不耗時(shí)），然后重新開(kāi)始計(jì)數(shù)。然而，這種方法的局限性在圖11中顯而易見(jiàn)：脈沖必須能夠被單獨(dú)分辨。如果第二個(gè)脈沖在第一個(gè)脈沖期間發(fā)生，則只會(huì)檢測(cè)到一個(gè)脈沖，導(dǎo)致后續(xù)測(cè)量的亮度值偏低。脈沖是否能夠分離取決于脈沖之間的時(shí)間間隔和脈沖寬度。較寬的脈沖只適用于較低的亮度，因?yàn)榉駝t脈沖之間會(huì)過(guò)于接近，容易發(fā)生重疊。較窄的脈沖即使在高強(qiáng)度（即較短的脈沖間隔）下也能產(chǎn)生良好的計(jì)數(shù)結(jié)果。
典型的PMT輸出的脈沖寬度約為20納秒，可以有效區(qū)分。如果光子總是以相同的時(shí)間間隔到達(dá)，則計(jì)數(shù)率可高達(dá)每秒5000萬(wàn)次（50 Mcps）。然而，由于光子的到達(dá)是隨機(jī)的，脈沖重疊的概率會(huì)大大增加，從而降低了最高計(jì)數(shù)率。這里所說(shuō)的最高計(jì)數(shù)率是指，當(dāng)超過(guò)該計(jì)數(shù)率時(shí)，實(shí)際觸發(fā)的光電子數(shù)量與測(cè)量到的脈沖數(shù)量之間的關(guān)系不再呈線性。誠(chéng)然，這是一個(gè)取決于誤差容限的任意定義。如果允許的偏差僅為1%，則線性關(guān)系會(huì)在0.5 Mcps時(shí)結(jié)束；如果允許10%的偏差，則線性關(guān)系會(huì)在5 Mcps時(shí)結(jié)束。在日常實(shí)踐中，1%的精度通常難以達(dá)到，而10%則超過(guò)了容忍閾值。例如，可以將閾值設(shè)定為6%，從而在計(jì)數(shù)率略高于10 Mcps時(shí)獲得有效的測(cè)量結(jié)果。
如果我們暫時(shí)假設(shè)沒(méi)有亮度波動(dòng)（例如，通過(guò)照射一個(gè)固定點(diǎn)，不進(jìn)行掃描），則光子平均會(huì)均勻地到達(dá)探測(cè)器，但其到達(dá)是隨機(jī)的。在這種泊松過(guò)程中，光子之間的時(shí)間間隔可以用指數(shù)分布來(lái)描述。我們無(wú)需在此深入探討細(xì)節(jié)，只需說(shuō)明此過(guò)程可以用精確的數(shù)學(xué)術(shù)語(yǔ)來(lái)描述。在一定程度上，我們可以利用它來(lái)計(jì)算由脈沖重疊引起的、導(dǎo)致線性偏差的誤差。然而，如果已知誤差，我們就可以使用測(cè)得的脈沖數(shù)反推實(shí)際到達(dá)的脈沖數(shù)。這種方法在未經(jīng)校正時(shí)誤差變得顯著的脈沖率的五倍范圍內(nèi)有效。因此，這種校正方法被稱(chēng)為線性化。這是一種用于擴(kuò)展測(cè)量范圍的、廣為人知且有充分描述的方法[7]。

圖 12：圖12：通過(guò)校正統(tǒng)計(jì)概率實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)率的線性化。請(qǐng)注意對(duì)數(shù)x軸[6]。
與原始計(jì)數(shù)的脈沖（對(duì)應(yīng)于光子）不同，這種線性化方法（類(lèi)似于展寬）在計(jì)算中會(huì)產(chǎn)生小數(shù)以及整數(shù)。這反過(guò)來(lái)會(huì)影響直方圖，因?yàn)橹狈綀D通常只繪制整數(shù)，例如灰度值。無(wú)論如何，這些能量通道的寬度通�？偸呛愣ǖ�，并且總是可以將任何小數(shù)轉(zhuǎn)換為整數(shù)，例如從0開(kāi)始然后簡(jiǎn)單地繼續(xù)計(jì)數(shù)。因此，線性化會(huì)導(dǎo)致直方圖中出現(xiàn)拍頻效應(yīng)，從而使個(gè)別能量值遠(yuǎn)超出直方圖的包絡(luò)線。雖然起初可能令人困惑，但這是對(duì)統(tǒng)計(jì)校正后的光子數(shù)的精確表示。

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