一種整合DDA-PRM-dMRM的新方案實現(xiàn)高風險HCPs的定性定量分析

宿主細胞蛋白（HCPs）是生物治療藥物中與工藝相關(guān)的關(guān)鍵雜質(zhì)，會影響藥物的穩(wěn)定性和安全性。治療性蛋白與殘留HCPs成分的動態(tài)范圍極大，往往大于5個數(shù)量級，導(dǎo)致高風險HCPs檢測更加困難。LC-MS/MS檢測可以突破傳統(tǒng)免疫分析方法在靈敏度和特異性方面的局限性，已成為有效檢測和定量HCPs的關(guān)鍵工具，可指導(dǎo)下游純化工藝并監(jiān)測HCPs清除效果。
 
2025年6月，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的張金蘭教授課題組在Journal of Proteome Research發(fā)表了一套新的HCPs監(jiān)測方法^[1]，首先通過數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）構(gòu)建包含所有潛在HCPs的CHO細胞蛋白庫，然后對38種已報道的高風險HCPs進行了平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）和多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）交叉驗證，最終篩選出28種高風險HCPs及其特異性肽段和離子對信息。下一步建立并驗證了一種新的動態(tài)MRM（dMRM）方法，可以同時定量28種高風險HCPs。最后，應(yīng)用上述策略分析了五個純化的單克隆抗體制備工藝樣品，通過DDA方法對未知HCPs進行全面分析，使用dMRM方法對28種已知高風險HCPs進行快速定量。總體而言，該策略能夠?qū)σ阎�和未知HCPs進行全面分析，指導(dǎo)生物制藥工藝的優(yōu)化。本研究中DDA數(shù)據(jù)分析使用PEAKS Studio完成。

---

潛在宿主細胞蛋白庫構(gòu)建
許多研究傾向基于數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）的方法來檢測HCPs，這樣可以減少低豐度信號的缺失，提高蛋白質(zhì)組的覆蓋深度，但DIA的譜圖處理更加復(fù)雜，也容易受到復(fù)雜基質(zhì)的信號干擾。本研究中，作者選擇了以DDA的方式構(gòu)建HCPs蛋白質(zhì)譜圖庫，基于該庫直接生成PRM/MRM離子對列表，可確保工藝開發(fā)階段方法的一致性。為確保對低豐度HCPs鑒定的全面性，作者對中國倉鼠卵巢（CHO）細胞提取的全蛋白溶液，采用了兩種不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS試劑盒。結(jié)果顯示，EasyPep MS試劑盒處理的樣本蛋白鑒定更多。最終采用EasyPep MS試劑盒、400ng質(zhì)譜進樣和150min梯度的方法進行后續(xù)實驗（Figure S1）。最終構(gòu)建了一個包含6863個蛋白質(zhì)、143166條多肽的譜圖庫，超過了目前已報道的CHO細胞蛋白庫。
 

---

高風險HCPs預(yù)測及驗證
在上述已建立的譜圖庫基礎(chǔ)上，作者又整合了NIST CHO多肽譜圖庫，然后利用整合后的譜圖庫，在已報道的38種高風險HCPs中，預(yù)測出了36種蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通過PRM和MRM對這36種蛋白的特異性肽段進行了交叉驗證，有效消除了背景和非特異性肽段的干擾，排除了在MRM和PRM數(shù)據(jù)中譜峰均較差的8個蛋白，最終驗證了28種高風險HCPs的47條unique peptides和141個 transitions（Table 2）。Figure 2展示了六類高風險HCPs中代表性肽段的b/y離子碎裂譜圖、PRM和MRM色譜圖。這些transitions在PRM模式下具有高特異性，在MRM模式下具有出色的靈敏度和重現(xiàn)性，確保了定量的可靠性。

---

方法驗證
在生物制藥下游生產(chǎn)中，去除殘留的HCPs對產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。大多數(shù)單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)工藝需要將雜質(zhì)降低至100ppm以下，不過某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于這個標準的情況下仍然影響產(chǎn)品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范圍內(nèi)對標準曲線進行了驗證（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之間）。首先篩選出28個高風險HCPs中響應(yīng)最高的28條peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(¹³C₆¹⁵N₄-R)作為內(nèi)標（IS）。為了模擬實際樣品狀態(tài)并將干擾降至最低，選擇以人血漿來源的IgG作為基質(zhì)，然后配置至少6個濃度梯度繪制標準曲線，得到的相關(guān)系數(shù)R²超過0.98。結(jié)果如Table S3所示，10種肽具有良好的線性（0.1 – 100nmol/L），21種肽的定量下限低于1 nmol/L），25種肽的上限達到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的線性范圍較窄外，所有肽均涵蓋了下游純化過程中典型的HCP濃度范圍。此外，作者又在實際條件下對穩(wěn)定性進行了驗證，包括在室溫（RT）下24小時的短期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性（從−80°C到室溫的三個凍融循環(huán)）以及在4°C下7天的長期穩(wěn)定性。所有肽在相對誤差（RE）和相對標準偏差（RSD）±15.0%范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。所有驗證結(jié)果均符合中國藥典對生物樣品的標準，這充分證明了該方法對28種高風險宿主細胞蛋白進行精確定量的穩(wěn)健性，適用于生物制藥過程監(jiān)測和質(zhì)量控制。

---

方法應(yīng)用
作者將上述方法應(yīng)用于VEGF單克隆抗體下游純化的5個樣本，檢測其中的28種已知的高風險HCPs。DDA模式在細胞培養(yǎng)液（HCCF）中鑒定到1533種HCPs，在純化后的原料藥中鑒定到38種（Figure 4）。此外，DDA方法鑒定出了一些未被dMRM覆蓋的高風險HCP（如G3GTT2和A4URF0），為全面表征HCP提供了補充信息，并證明了其在監(jiān)測未知高風險HCP方面的關(guān)鍵價值。蛋白A親和層析和親和沉淀過濾（ADF）的去除效率分別達到74%和91%，表明它們在清除HCP方面的有效性。陽離子交換層析（CEX）階段沒有顯著變化。值得注意的是，一些在HCCF中未檢測到的HCP在下游純化過程中被檢測到，這可能是因為基質(zhì)干擾減少增強了低豐度分子的信號響應(yīng)。在最終藥物中，仍檢測到三種低ppm水平的高風險HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它們可能導(dǎo)致聚山梨酯和藥物降解，甚至增加免疫原性風險。盡管這三種HCPs在蛋白A親和層析后顯著減少，但在后續(xù)步驟中其清除率趨于平穩(wěn)，這揭示了當前純化流程中的選擇性局限性。

---

總結(jié)
該研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（驗證特異性）和 dMRM（快速定量已知高風險 HCPs）的不同方法，實現(xiàn)了HCPs的全面分析，為生物制藥過程中HCPs的監(jiān)測提供了高效、全面的解決方案，助力優(yōu)化純化工藝、提升藥物質(zhì)量可控性，符合QbD理念。但目前僅基于 CHO-K1 細胞系，可能無法覆蓋其他 CHO 亞型或變異株的 HCPs，未來可擴展至其他宿主細胞系或微生物表達系統(tǒng)，結(jié)合人工智能和深度學(xué)習，擴展低豐度 HCPs的特征譜圖數(shù)據(jù)，建立HCP譜圖庫共享平臺。
 
文獻
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369

---

作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機器學(xué)習和先進算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS^®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS^®️ Studio，PEAKS^®️ Online，PEAKS^®️ GlycanFinder, PEAKS^®️ AB，DeepImmu^®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com