貓冠狀病毒S真核蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)選擇、蛋白分子量及制備流程

貓冠狀病毒S蛋白（Spike 蛋白，刺突蛋白）是病毒包膜表面的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)識別宿主細(xì)胞受體并介導(dǎo)病毒入侵，其構(gòu)象和功能依賴于復(fù)雜的翻譯后修飾（如糖基化），因此真核表達(dá)系統(tǒng)是獲取具有天然活性 S 蛋白的主要手段。以下從結(jié)構(gòu)、真核表達(dá)系統(tǒng)選擇、蛋白分子量及制備流程等方面詳細(xì)介紹：

貓冠狀病毒（FCoV）的 S 蛋白是一種 Ⅰ 型跨膜糖蛋白，整體結(jié)構(gòu)分為三個(gè)功能區(qū)：

• 胞外區(qū)：包含受體結(jié)合域（RBD）和融合肽（FP），RBD 可特異性結(jié)合宿主細(xì)胞表面的氨肽酶 N（APN）受體，是病毒入侵的關(guān)鍵識別位點(diǎn)；融合肽在病毒與宿主細(xì)胞膜接觸后介導(dǎo)膜融合。
• 跨膜區(qū)：錨定 S 蛋白于病毒包膜或感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
• 胞內(nèi)區(qū)：較短，可能參與病毒組裝過程中的信號傳遞。

S 蛋白在天然狀態(tài)下以同源三聚體形式存在，且需經(jīng)過糖基化修飾（約含 20-30 個(gè) N - 糖基化位點(diǎn)），這些修飾對維持蛋白構(gòu)象、受體結(jié)合能力及免疫原性至關(guān)重要。

由于 S 蛋白需要復(fù)雜的糖基化修飾和正確的三聚體折疊，原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）無法滿足需求，因此必須采用真核表達(dá)系統(tǒng)。常用系統(tǒng)及其特點(diǎn)如下：

1. 昆蟲細(xì)胞 - 桿狀病毒系統(tǒng)（BEVS）

   • 優(yōu)勢：可高效表達(dá)大分子量蛋白，糖基化修飾接近哺乳動物細(xì)胞（雖略簡單，但足以支持 S 蛋白的基本功能），且易于大規(guī)模培養(yǎng)。
   • 應(yīng)用：常用于制備 S 蛋白三聚體，用于受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)或疫苗候選抗原。

2. 哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)

   • 常用細(xì)胞：HEK293（人胚腎細(xì)胞）、CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）。
   • 優(yōu)勢：糖基化修飾最接近天然病毒 S 蛋白，能準(zhǔn)確折疊形成功能性三聚體，適合研究蛋白的天然構(gòu)象和免疫原性。
   • 不足：表達(dá)量相對較低，成本較高，適合小批量、高活性的 S 蛋白制備。

3. 酵母系統(tǒng)（如畢赤酵母）

   • 優(yōu)勢：操作簡便、成本低，可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。
   • 局限性：糖基化修飾與哺乳動物差異較大（高甘露糖型），可能影響 S 蛋白的受體結(jié)合或免疫原性，應(yīng)用較少。

天然 S 蛋白的分子量因糖基化修飾程度而異：

• 未糖基化的 S 蛋白前體（單體）分子量約為180-200 kDa（由約 1400-1500 個(gè)氨基酸組成）。
• 經(jīng)真核系統(tǒng)表達(dá)并糖基化后，單體分子量增至200-250 kDa；三聚體分子量約為600-750 kDa。

1. 基因優(yōu)化與載體構(gòu)建

   • 從 FCoV 毒株中克隆 S 蛋白全長或功能片段（如 RBD、三聚體穩(wěn)定型 S 蛋白）的基因，根據(jù)表達(dá)宿主（如 HEK293）進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以提高表達(dá)效率。
   • 將基因插入真核表達(dá)載體（如 pcDNA3.1），載體需含信號肽（引導(dǎo)蛋白分泌至細(xì)胞外）、標(biāo)簽（如 His-tag、Fc-tag，便于純化）及啟動子（如 CMV 啟動子）。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)篩選

   • 采用脂質(zhì)體或電穿孔法將重組載體轉(zhuǎn)染至哺乳動物細(xì)胞（如 HEK293F 懸浮細(xì)胞），通過抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株（或瞬時(shí)表達(dá)）。
   • 優(yōu)化培養(yǎng)條件（溫度 37℃、CO₂濃度 5%），收集細(xì)胞上清（分泌型表達(dá)）或細(xì)胞裂解液（胞內(nèi)表達(dá)），通過 Western blot 檢測 S 蛋白表達(dá)情況。

3. 蛋白純化

   • 基于標(biāo)簽進(jìn)行親和層析：如 His-tag 蛋白用 Ni²⁺-NTA 柱，F(xiàn)c-tag 蛋白用 Protein A/G 柱。
   • 進(jìn)一步純化：通過離子交換層析、凝膠過濾層析去除雜蛋白，獲得高純度 S 蛋白。
   • 三聚體純化：若目標(biāo)為功能性三聚體，可利用凝膠過濾層析分離單體與三聚體組分（三聚體分子量更大，出峰更早）。

4. 活性鑒定

   • 構(gòu)象驗(yàn)證：通過圓二色譜（CD）或低溫電鏡分析蛋白折疊狀態(tài)。
   • 功能驗(yàn)證：采用受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（如 ELISA 檢測與 APN 受體的結(jié)合能力）或假病毒中和實(shí)驗(yàn)（評估其誘導(dǎo)中和抗體的潛力）。

1. 病毒入侵機(jī)制研究：通過真核表達(dá)的 S 蛋白，解析其與宿主受體（APN）的相互作用，揭示 FCoV 的感染機(jī)制。
2. 診斷試劑開發(fā)：以 S 蛋白（尤其是 RBD）為抗原，檢測貓血清中的中和抗體，評估感染或免疫狀態(tài)（中和抗體可反映對病毒的保護(hù)力）。
3. 疫苗研發(fā)：S 蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的關(guān)鍵靶標(biāo)，真核表達(dá)的功能性 S 蛋白（如三聚體）是亞單位疫苗的核心成分，可激發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。

貓冠狀病毒 S 真核蛋白的制備依賴于能提供復(fù)雜糖基化修飾的真核表達(dá)系統(tǒng)（如哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞），其天然構(gòu)象和功能對病毒入侵機(jī)制研究、診斷及疫苗開發(fā)至關(guān)重要。相較于原核表達(dá)，真核系統(tǒng)雖成本較高，但能保證 S 蛋白的生物學(xué)活性，是相關(guān)應(yīng)用的首選方案。