Ion Torrent PGM用于遺骨驗(yàn)證揭秘理查三世身世之謎

2014年12月2日 紐約（GenomeWeb）——近日，由萊斯特大學(xué)研究人員領(lǐng)導(dǎo)的一支國(guó)際合作研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用家譜數(shù)據(jù)和遺傳分析，驗(yàn)證出在英國(guó)停車場(chǎng)下發(fā)現(xiàn)的一具遺骨確實(shí)屬于理查三世國(guó)王，從而成功解決一項(xiàng)擱置超過(guò)500年的法醫(yī)案例。

 “掌握任何已知?dú)v史人物的遺傳數(shù)據(jù)都足以讓人興奮，更何況是一位英國(guó)國(guó)王。”對(duì)本項(xiàng)研究提供了部分資助的威康信托基金會(huì)文化與社會(huì)部門負(fù)責(zé)人Simon Chaplin說(shuō)道，“這一信息的發(fā)現(xiàn)豐富了現(xiàn)有的理查三世的研究資料，并進(jìn)一步提示我們，研究人類遺體能幫助我們了解歷史。我們期待，在將來(lái)我們能夠了解更多關(guān)于理查三世的故事�！�

理查三世于1483年即位，并在兩年后的博斯沃思戰(zhàn)役中去世，是最后一位在戰(zhàn)爭(zhēng)中死去的英國(guó)國(guó)王。歷史記錄表明，理查三世的遺體被運(yùn)送至萊斯特，并埋葬在名為Grey Friars的中世紀(jì)教堂中。但是，1538年該修道院被解散，其中的大部分建筑也在隨后的年代里逐漸拆除。

盡管有傳聞稱理查三世的遺體被挖出并丟入萊斯特的Soar河中，但大多數(shù)歷史學(xué)家仍相信他仍安穩(wěn)地躺在修道院曾經(jīng)矗立的位置。不過(guò)他的墓地的精確位置仍不知曉。

2012年，在Grey Friars教堂原址處發(fā)掘出了一具遺骨，其考古學(xué)斷代及放射性碳測(cè)定年代的結(jié)果均顯示該遺骨可能屬于理查。對(duì)該遺骨進(jìn)行的進(jìn)一步分析表明它屬于一位30至34歲的男性，并有著嚴(yán)重的脊柱側(cè)彎及多處戰(zhàn)爭(zhēng)傷處——所有這些均與這位國(guó)王的已知信息相一致。

為了一勞永逸地證實(shí)該遺骨（在發(fā)掘出時(shí)被命名為1號(hào)遺骨）確實(shí)屬于理查三世，萊斯特大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)這位國(guó)王的現(xiàn)有親屬及親屬的遺體進(jìn)行了DNA分析，對(duì)包括線粒體全基因組（屬于母系遺傳）和Y染色體標(biāo)記（屬于父系遺傳）在內(nèi)的多個(gè)關(guān)鍵遺傳標(biāo)志進(jìn)行了研究。

科學(xué)家們首先使用芯片DNA雜交方法對(duì)1號(hào)遺骨的Y染色體SNP位點(diǎn)進(jìn)行了研究，之后，研究人員使用靶向PCR擴(kuò)增方法，將特定擴(kuò)增產(chǎn)物在Ion Torrent PGM平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序以作進(jìn)一步分型，并使用Promega PowerPlex Y23系統(tǒng)分析獲得了一個(gè)STR單倍型。

當(dāng)將實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)已知的5位理查三世的父系親屬的分析進(jìn)行對(duì)比時(shí)，研究人員并未發(fā)現(xiàn)遺傳相關(guān)性。不過(guò)鑒于假父系的可能性，在理查三世與其后代間的所有世代中據(jù)估計(jì)有高達(dá)16%的假父系可能，研究人員認(rèn)為這一結(jié)果并不能作為決定性因素。

研究人員注意到，假母系的可能性顯然要比假父系可能性低很多。隨后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)1號(hào)遺骨的線粒體DNA（mtDNA）進(jìn)行了檢測(cè)，并分別與理查三世的母系19和21代的兩位個(gè)體的樣本進(jìn)行了比對(duì)。

他們首先對(duì)兩位親屬的mtDNA對(duì)照區(qū)域使用Sanger測(cè)序法對(duì)雙鏈進(jìn)行了平行雙重測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)體或個(gè)體間的平行雙樣間不存在序列差異。

依研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications中所述，1號(hào)遺骨的DNA分別交由兩個(gè)專門從事古代DNA分析的不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行獨(dú)立提取，隨后對(duì)其mtDNA對(duì)照區(qū)域上的三個(gè)高度可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。他們還提到，他們另外還對(duì)PCR克隆產(chǎn)物進(jìn)行了Sanger測(cè)序，除了兩處可認(rèn)為是古代DNA中常見的DNA損傷模式外，并未觀察到序列差異。

在1號(hào)遺骨與理查的后代間，研究人員發(fā)現(xiàn)了一處完美匹配，且研究人員發(fā)現(xiàn)其在研究的遺傳時(shí)間周期內(nèi)在所有母系親屬中均保持一致。

為了測(cè)定完整mtDNA的相似性，研究人員隨后對(duì)這三份樣品均進(jìn)行了線粒體全基因組測(cè)序。對(duì)于現(xiàn)代樣品，通過(guò)兩輪平行雙重長(zhǎng)鏈PCR對(duì)其完整線粒體基因組進(jìn)行了擴(kuò)增，隨后使用Ion Torrent PGM進(jìn)行了測(cè)序。

同時(shí)，研究人員使用了芯片DNA雜交捕獲方法對(duì)1號(hào)遺骨的mtDNA序列進(jìn)行了全基因組測(cè)序，從16組提取制得了24個(gè)測(cè)序文庫(kù)，其中探針是根據(jù)兩位現(xiàn)代親屬的mtDNA序列而設(shè)計(jì)的。

研究表明，在1號(hào)遺骨與一位理查的親屬之間存在完美的全基因組序列匹配，與另一位親屬也只有1個(gè)堿基的差異，因而可認(rèn)為在所研究的時(shí)間周期內(nèi)母系親屬個(gè)體間這些序列保持一致。而與含26127份歐洲全mtDNA對(duì)照區(qū)域序列的數(shù)據(jù)庫(kù)與1832份英倫諸島樣品的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的比較表明，這種mtDNA的完美匹配不太可能是由于偶然因素造成的。

最后，研究團(tuán)隊(duì)還對(duì)1號(hào)遺骨進(jìn)行了瞳孔顏色及發(fā)色的DNA分型，結(jié)果表明有96%的可能性為藍(lán)色瞳孔，77%的可能性為金發(fā)，這與理查三世留存的早期肖像相一致。

 “我們的文章囊括了對(duì)發(fā)掘自萊斯特Grey Friars原址的1號(hào)遺骨所做的所有遺傳及宗譜分析鑒定，并首次將所有證據(jù)線索綜合起來(lái)從而得到了這具遺骸的鑒定結(jié)果�！盢ature Communications研究工作的首席作者Turi King說(shuō)道，“即使在我們最保守的分析中，仍然有著壓倒性的證據(jù)表明這確實(shí)是理查三世國(guó)王的遺骸，從而解決了這一超過(guò)500年的尋人案例�！�

 “這些證據(jù)結(jié)合起來(lái)共同證實(shí)了遺骸屬于理查三世�！辟Y深作者Kevin Schurer提到，“母系后代的三角測(cè)量尤為重要�？紤]到非親生的發(fā)生率，Y染色體譜系中斷并不令人非常驚訝，不過(guò)這會(huì)產(chǎn)生一系列關(guān)于繼承權(quán)的有趣的推測(cè)問(wèn)題�！�

正如文章作者所指出的，在理查三世登基前幾年發(fā)生的一起或數(shù)起假父系事件可能引發(fā)對(duì)理查三世死后人們對(duì)大不列顛王室合法性的懷疑。