細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)具體過程
細(xì)胞免疫熒光染色 適用于鑒定細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。
實(shí)驗(yàn)過程 (48孔板為例)：
1、細(xì)胞種植：將細(xì)胞消化后按照所需濃度種植于48孔板，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
2、固定：取出48孔板，棄去培養(yǎng)基，每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。
3、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復(fù)3次。
4、通透：每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100，室溫靜置15min。（膜表達(dá)的蛋白鑒定建議不通透，具體參考抗體說明書）
5、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復(fù)3次。
6、封閉：每孔加入500μl 5%牛血清封閉液，37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中過夜，棄去液體。
7、一抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的抗體（稀釋比例參考抗體說明書），37°C靜置2h或者4℃過夜。
8、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
9、封閉：每孔加入200μl 5%牛血清封閉液，室溫封閉15min。（本底高的可以加這一步）
10、二抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的二抗（種屬和一抗的要對(duì)應(yīng)，舉例：一抗是來源是兔抗X，二抗就用Y 抗兔-熒光，稀釋比例參考抗體說明書），37℃避光孵育1h。
11、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
12、染核：Hoechst 濃度2μg/ml，每孔200 μl，室溫避光染色15min。
13、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復(fù)3次。
14、拍照：洗滌完畢每孔加入200μl PBS,將細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，選擇所需倍數(shù)，拍照保存。
