在血清樣品中通過化學(xué)發(fā)光免疫實(shí)驗(yàn)檢測新冠 IgG 抗體

瀏覽次數(shù)：2799　發(fā)布日期：2022-4-14　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

簡介

作為新冠病毒免疫反應(yīng)的一部分，感染者體內(nèi)會產(chǎn)生病毒特異性抗體，在出現(xiàn)癥狀后的一至三周內(nèi)，這些抗體可以在血液中被檢測到。IgG 和 IgM 幾乎同時(shí)出現(xiàn)，而 IgG 在更長時(shí)間內(nèi)維持一個高水平。在血清中，由于感染病毒或接種疫苗而產(chǎn)生的可檢測到的抗體可以防范將來被新冠病毒感染。但這些抗體持續(xù)的時(shí)間長短和提供保護(hù)的程度是有關(guān)新冠病毒仍需密切調(diào)查的眾多問題之一。

在人體血清中，通過免疫實(shí)驗(yàn)來檢測新冠抗體是增進(jìn)我們了解這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega Lumit^TMDx SARS-CoV-2 免疫實(shí) 驗(yàn) 使用了帶有 SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個亞基，只有當(dāng)它們通過結(jié)合相互靠近時(shí)，才具有功能 ) 標(biāo)記的新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域(RBD) 的一個片段。當(dāng)這些標(biāo)記過的病毒蛋白片段與含有新冠病毒抗體的樣品一起孵育時(shí)，他們將與抗體結(jié)合，將 SmBiT和 LgBiT 兩個亞基結(jié)合到一起，并產(chǎn)生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測試劑，在微孔板光度計(jì)上測量產(chǎn)生的熒光信號。

Lumit 實(shí)驗(yàn)中，樣品的添加和測讀如圖 1 所示。沒有清洗的步驟并且一小時(shí)內(nèi)測得結(jié)果，使得這個實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于高通量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀具有超冷光電倍增管(PMT)，可以為 Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)提供高靈敏度的發(fā)光檢測。

優(yōu)點(diǎn)

•放大高通量篩選，省去清洗步驟，
•樣品體積僅需 15 微升，

• 一小時(shí)內(nèi)測得結(jié)果。

圖 1 Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)的工作流程。添加 - 孵育 - 測讀全流程將在一小時(shí)內(nèi)完成，并且可以用于自動化和高通量篩選。

材料

• Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)試劑盒 (Promega cat. #VB1080)

• 新冠病毒陽性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)

• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)

• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)

• SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀 ( 美谷分子儀器 )

方法
實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備和微孔板的操作如下 ( 更多的細(xì)節(jié)，請參閱Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊)：

1.
制備 1x Lumit-Dx 免疫實(shí) 驗(yàn) 稀釋緩沖液 ( 添加 5mL 10xLumit-Dx 免疫實(shí) 驗(yàn) 稀釋緩沖液至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。

2.
來源于新冠患者或健康受試者的30 uL 血清樣本，與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液混合。有足夠的體積進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)；通常每個孔僅需 15 uL 樣品。

3.
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現(xiàn) 配現(xiàn) 用，配方如下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍(lán)色蓋子 )。添加完畢后，輕微地顛倒混勻。

4.
Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照、Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑，解凍后放置于室溫及時(shí)使用。簡短的離心可使管壁內(nèi)容物甩至管底。

5.
按如下操作，添加試劑至白色 96 孔板中：

• 每個孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，

• 20uL 稀釋的病人血清樣本，三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陽性對照，三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陰性對照，三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑，三個重復(fù)，

6.
將微孔板封蓋，室溫孵育 20 分鐘。

7.
孵育后，制備 Lumit-Dx 檢測試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測底物 ( 灰色蓋子 )，現(xiàn)配現(xiàn)用。輕微地顛倒混勻。

8.
60 uL 檢測試劑加入孔中，室溫孵育 3 分鐘。

9.
使用 SpectraMax iD5 讀板機(jī)測讀，如表 1 所設(shè)置。測讀完成后，相對發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。在模板中，這些孔被分配到不同的組中，各組產(chǎn)生的表單被用于計(jì)算和顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控按照試劑盒技術(shù)手冊進(jìn)行評估。 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑、Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照都被用于確保最合適的實(shí)驗(yàn)性能。相比于 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑，陽性對照必須產(chǎn)生更高的相對發(fā)光單位值，陰性對照必須產(chǎn)生更低的相對發(fā)光單位值。如果這些條件不滿足，微孔板測讀結(jié)果將是無效的。

表 1 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)中，SpectraMax iD5 讀板機(jī)儀器參數(shù)設(shè)置。全波長 ( 無波長選項(xiàng) ) 設(shè)置被用于最大化的發(fā)光檢測。讀板高度在 SoftMaxPro 軟件中的讀板高度調(diào)整設(shè)置之前進(jìn)行了優(yōu)化。

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過每一個測試樣品 (S) 的相對發(fā)光單位 (RLU) 與實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑 (C) 的平均相對發(fā)光單位的比值計(jì)算得到。 S/C 比值≥ 1，樣品中新冠抗體為陽性；S/C 比值＜ 1，樣品中新冠抗體為陰性。實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑的平均相對發(fā)光單位是 548，六位新冠患者樣本的平均相對發(fā)光單位從 1787 至 14155 不等，健康受試者的相對發(fā)光單位是 86。

如表 2 顯示，新冠患者樣本的比值都是大于 1，顯示陽性結(jié)果，而健康受試者的比值都是小于 1，顯示陰性結(jié)果。

備注：此實(shí)驗(yàn)樣品板也在 SpectraMax i3X, SpectraMax M5,SpectraMax L 酶標(biāo)儀上測讀，獲得相似的結(jié)果。

表 2 在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)上獲得的 Lumit Dx 新冠病毒實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。所有的樣品和實(shí)驗(yàn)對照都有三次重復(fù)，并計(jì)算出變異系數(shù) CV值。運(yùn)用 SoftMax Pro 軟件計(jì)算并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

結(jié)論

研究人員通過檢測大量的新冠病毒感染患者和已接種疫苗的人的血清樣本，進(jìn)一步了解免疫反應(yīng)發(fā)生和持續(xù)的時(shí)間，因此，大量的血清樣本新冠抗體的快速檢測變得尤為迫切。 Lumit Dx新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)為科學(xué)家提供了一個簡化的流程，可以更快速地獲得結(jié)果。聯(lián)合使用 SpectraMax iD5 讀板機(jī)和 SoftMaxPro 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算和分析更加自動化，減少手動操作時(shí)間，可以有更高的通量。