癌癥免疫治療突破性新策略抗原呈遞細(xì)胞外囊泡的開發(fā)

癌癥仍是全球主要疾病負(fù)擔(dān)和死亡原因之一。2022 年，全球新發(fā)癌癥病例接近 2000 萬，預(yù)計(jì) 2050 年全球?qū)⑿略龀�過 3500 萬癌癥病例。而傳統(tǒng)治療方法，如化療、放療和免疫治療等，常因缺乏特異性、毒副作用大以及易產(chǎn)生藥物耐藥性等問題，限制了其臨床應(yīng)用。因此，亟待開發(fā)新型、高效、低毒的新型治療策略。

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）因其生物相容性高、免疫原性低和高效的藥物遞送能力，已成為極具潛力的藥物遞送平臺(tái)，為癌癥治療打開了突破性方向。日本金澤大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)近期開發(fā)了一種有前景的癌癥治療新方法，有望成為更具針對性的、副作用更少的癌癥療法。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種特殊的工程化 EVs，稱為抗原呈遞細(xì)胞外囊泡（antigen-presenting EVs, AP-EVs），可以激活腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞。這些 AP-EVs 能夠把免疫增強(qiáng)信號(hào)高效遞送至腫瘤微環(huán)境，激活抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞，并將“冷”腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)化為“熱”微環(huán)境，在與 PD-1 療法聯(lián)用時(shí)顯著增強(qiáng)抗腫瘤效果。這種新方法不僅增強(qiáng)了免疫反應(yīng)，同時(shí)還減少了傳統(tǒng)癌癥治療中常見的副作用。該成果發(fā)表在 2025 年 3 月 28 日的《Journal of Extracellular Vesicles》。

AP-EVs 的構(gòu)建與表征
研究團(tuán)隊(duì)首先將卵清蛋白肽-單鏈 MHC I 三聚體（pMHCI）與 CD81 融合，IL-2 通過 GS 連接子整合至 CD81 的第二個(gè)外部環(huán)，并將 CD80 與 CD9 融合，成功構(gòu)建了同時(shí)表達(dá) pMHCI、CD80 和 IL-2 的 AP-EVs（圖1a）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，確認(rèn)磁珠富集的 AP-EVs 表面高表達(dá) pMHCI、CD80 和 IL-2（圖1b）。進(jìn)一步通過納米流式檢測技術(shù)（NanoFCM）在單個(gè) EV 水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超 50% 的 AP-EVs 表面同時(shí)表達(dá) IL-2 和 CD80（圖1d）。此外，納米顆粒追蹤分析和原子力顯微鏡分析確認(rèn) AP-EVs 的物理性質(zhì)與對照 EVs 類似（圖1e，f）。這些結(jié)果充分證實(shí)了 AP-EVs 的成功構(gòu)建，為其在后續(xù)的免疫調(diào)節(jié)和癌癥治療研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1. AP-EVs 的構(gòu)建與表征

體外實(shí)驗(yàn)：AP-EVs 選擇性擴(kuò)增抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞
研究團(tuán)隊(duì)將 OT-I T 細(xì)胞（注：OT-I T 細(xì)胞為 MHC I 類限制性的卵清蛋白特異性 CD8+ T 細(xì)胞）與不同濃度的 AP-EVs 或?qū)φ?nbsp;EVs 共同培養(yǎng)，使用 CTV 標(biāo)記 OT-I T 細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析 OT-I T 細(xì)胞的增殖和激活情況，在體外評估 AP-EVs 擴(kuò)增抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AP-EVs 能夠以劑量依賴的方式激活 OT-I T 細(xì)胞（圖2a）。此外，研究者分別對比了高表達(dá)不同標(biāo)志物組合的 AP-EVs，發(fā)現(xiàn) pMHCI、CD80 和 IL-2 的協(xié)同作用是激活 T 細(xì)胞的關(guān)鍵（圖2b,c，其中，Signal 1：OVAp-MHCI；Signal 2：CD80；Signal 3：IL-2）。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)還評估了 AP-EVs 激活的 OT-I T 細(xì)胞的功能化程度，發(fā)現(xiàn) IFN-γ 和顆粒酶 B 顯著升高，表明這些 T 細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤免疫效應(yīng)因子并分化為細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）（圖2d）。此外，在與多克隆 T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，AP-EVs 僅選擇性擴(kuò)增 OT-I T 細(xì)胞，而對照 EVs 組并未表現(xiàn)出選擇性擴(kuò)增（圖2e-f）。這些結(jié)果表明，直接呈遞抗原、共刺激分子和細(xì)胞因子的 AP-EVs 能夠誘導(dǎo)抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞的強(qiáng)勁增殖。研究團(tuán)隊(duì)還評估了 AP-EVs 的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)即使在 4℃ 或 -20℃ 下保存 3 個(gè)月，AP-EVs 仍能保持與新鮮制備的 EVs 相當(dāng)?shù)幕钚�，這為 AP-EVs 的臨床應(yīng)用提供了便利（圖2g）。

圖2. AP-EVs 體外激活抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：AP-EVs 在小鼠模型中的免疫反應(yīng)
為了深入探究 AP-EVs 在體內(nèi)擴(kuò)增抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞的能力，研究團(tuán)隊(duì)選用 C57BL/6 小鼠接種 E.G7 腫瘤構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，接種后，轉(zhuǎn)移 OT-I T 細(xì)胞至小鼠，并注射 AP-EVs、對照 EVs 或 IL-2/抗 IL-2 單抗，收集脾臟和淋巴結(jié)，分析 T 細(xì)胞的增殖、活化、分化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AP-EVs 顯著增加了抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞比例（圖3a-c），并促進(jìn)分化為效應(yīng) T 細(xì)胞，同時(shí)提高 IFN-γ+ 的分泌（圖3d, e），相比 IL-2/抗 IL-2 單抗治療組，AP-EVs 能更有效地選擇性擴(kuò)增抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞，且副作用較少。此外，正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像顯示，AP-EVs 主要富集于小鼠的脾臟和肝臟（圖3f-g）。綜上，無論體內(nèi)體外，AP-EVs 能夠特異性擴(kuò)增抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞，并具有良好的體內(nèi)分布與免疫效果。

圖3. AP-EVs 在體內(nèi)激活抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞

AP-EVs 體內(nèi)抗腫瘤效果
研究團(tuán)隊(duì)為了評估 AP-EVs 體內(nèi)抗腫瘤能力，將 E.G7 腫瘤小鼠分為 AP-EVs 組、對照 EVs 組、IL-2/抗 IL-2 單抗組、AP-EVs 與抗 PD-1 聯(lián)合治療組，定期注射治療，檢測腫瘤生長情況和小鼠生存期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng) AP-EVs 治療后，內(nèi)源抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞擴(kuò)增的比例從 0.025% 提升至 3.58%（圖4a），且這些激活的 CTLs 能夠高效清除抗原特異性的靶細(xì)胞（圖4b），與對照 EVs 組、IL-2/抗 IL-2 單抗組相比，接受 AP-EVs 治療的小鼠腫瘤生長顯著延緩，生存期顯著提高（圖4c）。此外，AP-EVs 與抗 PD-1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，可進(jìn)一步抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期（圖4d），這表明 AP-EVs 與免疫檢查點(diǎn)抑制劑存在協(xié)同效應(yīng)。

圖4. AP-EVs 的體內(nèi)抗腫瘤效果

AP-EVs 改變腫瘤微環(huán)境
研究團(tuán)隊(duì)采用 E.G7 腫瘤小鼠模型，進(jìn)一步對 AP-EVs 的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 AP-EVs 處理的小鼠中，腫瘤組織中 CD8+ T 細(xì)胞的比例顯著增加，尤其是 IFN-γ+ CD8+ T 細(xì)胞，而 PD-1+ CD8+ T 細(xì)胞的比例顯著下降，表明 AP-EVs 能夠有效激活 CD8+ T 細(xì)胞，促進(jìn)其分泌免疫效應(yīng)因子（圖5a-d）。進(jìn)一步的 PET 成像動(dòng)態(tài)示蹤顯示，AP-EVs 在腫瘤組織中呈現(xiàn)顯著蓄積，其蓄積水平與肝臟和脾臟相當(dāng)（圖5e），并且隨給藥后時(shí)間推移，腫瘤組織中的 AP-EVs 蓄積呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢（圖5f）。這些發(fā)現(xiàn)表明，AP-EVs 不僅能夠直接激活抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞，還可以通過改變腫瘤微環(huán)境來增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖5. AP-EVs 對腫瘤微環(huán)境的影響

AP-EVs 的臨床轉(zhuǎn)化潛力
為了使 AP-EVs 能夠在臨床上應(yīng)用，研究團(tuán)隊(duì)通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除人細(xì)胞系中 β2m 的表達(dá)，確保 AP-EVs 能與人類免疫系統(tǒng)匹配，隨后，將目的基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，成功獲得能夠攜帶腫瘤抗原（NY-ESO-1）、CD80、IL-2 的人源化 AP-EVs（hAP-EVs）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hAP-EVs 能有效激活人原代 CD8+ T 細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并分化為具有細(xì)胞毒性的效應(yīng) T 細(xì)胞（圖6a-e）。此外，在 hAP-EVs 中加入細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）后，其激活 T 細(xì)胞的能力得到進(jìn)一步提升。這些發(fā)現(xiàn)不僅證實(shí)并凸顯了 hAP-EVs 在體外激活人類 T 細(xì)胞的治療潛力，更為其后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化奠定了重要基礎(chǔ)。

圖6. hAP-EVs 體外誘導(dǎo)人抗原特異性 T 細(xì)胞擴(kuò)增、活化和效應(yīng)功能

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)了一種抗原呈遞細(xì)胞外囊泡，通過共表達(dá)抗原肽-MHC 復(fù)合物、共刺激分子及細(xì)胞因子，高效激活并擴(kuò)增了腫瘤特異性 CD8+ T 細(xì)胞。AP-EVs 不僅能增強(qiáng)抗原特異性 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還能重塑腫瘤微環(huán)境，將“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤，從而顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，AP-EVs 與抗 PD-1 抗體聯(lián)用展現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，進(jìn)一步提升了抗腫瘤療效，為癌癥免疫治療開辟了新的聯(lián)合策略。該研究不僅創(chuàng)新性地提供了一種高效的腫瘤免疫調(diào)節(jié)手段，也極大地推動(dòng)了 EVs 作為藥物遞送平臺(tái)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，凸顯了其深遠(yuǎn)的科學(xué)價(jià)值與廣闊的臨床應(yīng)用前景。

NanoFCM 在單顆粒水平對 EVs 表面的多種蛋白進(jìn)行了精準(zhǔn)的表型分析，驗(yàn)證了 AP-EVs 是否成功表達(dá)了關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)成分。這種精確的單囊泡水平分析對于評估 AP-EVs 的質(zhì)量屬性和功能至關(guān)重要，是保障其有效激活抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞不可或缺的環(huán)節(jié)。NanoFCM 作為單 EV 表征的重要技術(shù)手段，將在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，加速推動(dòng) EV 藥物從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：
Lyu X, Yamano T, Nagamori K, et al. Direct delivery of immune modulators to tumour-infiltrating lymphocytes using engineered extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2025;14:e70035