光片線掃描結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡實(shí)現(xiàn)活體組織中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的高對(duì)比度成像

本研究成果由Patrick Byers、Thomas Kellerer、MiaomiaoLi、Zhifen Chen、Thomas Huser和Thomas Hellerer團(tuán)隊(duì)完成，題為《Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation》，于2025年6月在線發(fā)表于Nature Communications期刊。

重要發(fā)現(xiàn)
01核心技術(shù)原理
LiL-SIM的創(chuàng)新性設(shè)計(jì)包含三個(gè)關(guān)鍵突破：
光路改造：在傳統(tǒng)雙光子顯微鏡光路中添加柱面鏡生成線聚焦照明，通過(guò)多夫棱鏡和半波片組成的旋轉(zhuǎn)模塊實(shí)現(xiàn)照明圖案的0°、60°、120°三角度旋轉(zhuǎn)。多夫棱鏡的機(jī)械旋轉(zhuǎn)角度α可轉(zhuǎn)化為2α的光場(chǎng)旋轉(zhuǎn)，確保照明方向精確控制。

光片快門(mén)模式（LSS）：sCMOS相機(jī)的LSS模式將曝光限制在照明線掃描的相鄰7個(gè)像素帶（帶寬≈455nm），有效抑制散射熒光背景。與傳統(tǒng)滾動(dòng)快門(mén)（RS）模式相比，LSS在斑馬魚(yú)樣本40μm深度處將調(diào)制對(duì)比度從0.07提升至0.2。

序列線掃描替代干涉條紋：通過(guò)步進(jìn)式掃描單線焦點(diǎn)構(gòu)建照明圖案（非干涉產(chǎn)生），規(guī)避了生物組織中相位畸變對(duì)干涉條紋對(duì)比度的干擾。

深層組織成像：在斑馬魚(yú)樣本中，LSS模式將調(diào)制對(duì)比度維持閾值（>0.1）的成像深度從RS模式的<2μm擴(kuò)展至56μm。小鼠心肌組織成像中，LiL-SIM在70μm深度清晰分辨出肌動(dòng)蛋白纖維（間距≈146nm）。

小鼠心肌：70μm深度處仍可分辨肌動(dòng)纖維網(wǎng)絡(luò)，而傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像（WiL-2PM）因散射背景無(wú)法重建超分辨信息。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破散射組織成像瓶頸 
傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）在深層組織中因熒光散射導(dǎo)致調(diào)制對(duì)比度急劇下降。LiL-SIM首創(chuàng)將sCMOS相機(jī)的LSS模式與雙光子線掃描結(jié)合：

LSS的物理屏障作用：僅曝光照明線鄰近區(qū)域，徹底阻斷散射光子污染，使調(diào)制對(duì)比度在56μm深度仍滿足超分辨重建需求（>0.1）。

雙光子激發(fā)的天然優(yōu)勢(shì)：非線性激發(fā)僅聚焦區(qū)域產(chǎn)生信號(hào)，規(guī)避熒光回程散射對(duì)成像的影響。

靈活的參數(shù)調(diào)控：通過(guò)掃描電壓調(diào)節(jié)圖案間距，支持40×/1.15NA至100×/1.49NA多種物鏡。

多樣本兼容性：成功應(yīng)用于植物（松木）、哺乳動(dòng)物（小鼠心臟）和模式生物（斑馬魚(yú)），支持肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞核等多種熒光標(biāo)記。

總結(jié)與展望
LiL-SIM技術(shù)通過(guò)創(chuàng)新性地融合雙光子線掃描照明、光場(chǎng)旋轉(zhuǎn)與LSS檢測(cè)模式，為深層生物組織超分辨成像提供了高性價(jià)比解決方案。其核心價(jià)值在于：首次在無(wú)需復(fù)雜自適應(yīng)光學(xué)的條件下，將超分辨成像深度推進(jìn)至70μm，分辨率達(dá)150nm，并兼容常規(guī)熒光標(biāo)記。

當(dāng)前技術(shù)仍受限于掃描速度（需優(yōu)化多夫棱鏡旋轉(zhuǎn)延時(shí)）和光子效率（低雙光子截面染料受限），未來(lái)可通過(guò)振鏡K鏡替代棱鏡、平頂光束整形進(jìn)一步提升性能。該技術(shù)有望推動(dòng)神經(jīng)突觸、腫瘤微環(huán)境等深層動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供“平民化”超分辨成像工具。

Byers P, Kellerer T, Li M, Chen Z, Huser T, Hellerer T. Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation. Nat Commun. 2025 Jun 25;16(1):5386.

DOI:10.1038/s41467-025-60744-y.