光片線掃描結構光照明顯微鏡實現(xiàn)活體組織中亞細胞結構的高對比度成像
本研究成果由Patrick Byers、Thomas Kellerer、MiaomiaoLi、Zhifen Chen、Thomas Huser和Thomas Hellerer團隊完成，題為《Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation》，于2025年6月在線發(fā)表于Nature Communications期刊。
重要發(fā)現(xiàn)
01核心技術原理
LiL-SIM的創(chuàng)新性設計包含三個關鍵突破：
光路改造：在傳統(tǒng)雙光子顯微鏡光路中添加柱面鏡生成線聚焦照明，通過多夫棱鏡和半波片組成的旋轉模塊實現(xiàn)照明圖案的0°、60°、120°三角度旋轉。多夫棱鏡的機械旋轉角度α可轉化為2α的光場旋轉，確保照明方向精確控制。
光片快門模式（LSS）：sCMOS相機的LSS模式將曝光限制在照明線掃描的相鄰7個像素帶（帶寬≈455nm），有效抑制散射熒光背景。與傳統(tǒng)滾動快門（RS）模式相比，LSS在斑馬魚樣本40μm深度處將調制對比度從0.07提升至0.2。
序列線掃描替代干涉條紋：通過步進式掃描單線焦點構建照明圖案（非干涉產生），規(guī)避了生物組織中相位畸變對干涉條紋對比度的干擾。
02分辨率與深度突破分辨率驗證：使用100×/1.49NA物鏡成像190nm熒光微珠，LiL-SIM結合去卷積算法將分辨率從275nm（常規(guī)雙光子成像）提升至189–196nm。線對測試表明可解析150nm間距結構。
深層組織成像：在斑馬魚樣本中，LSS模式將調制對比度維持閾值（>0.1）的成像深度從RS模式的<2μm擴展至56μm。小鼠心肌組織成像中，LiL-SIM在70μm深度清晰分辨出肌動蛋白纖維（間距≈146nm）。
03生物樣本驗證松木組織（Pinusradiata）：在30μm深度處，LiL-SIM將樹脂導管細胞壁分辨率從299nm提升至156nm，傅里葉環(huán)相關（FRC）分析確認分辨率為163nm。
小鼠心肌：70μm深度處仍可分辨肌動纖維網(wǎng)絡，而傳統(tǒng)寬場成像（WiL-2PM）因散射背景無法重建超分辨信息。
創(chuàng)新與亮點
01突破散射組織成像瓶頸
傳統(tǒng)結構光照明顯微鏡（SIM）在深層組織中因熒光散射導致調制對比度急劇下降。LiL-SIM首創(chuàng)將sCMOS相機的LSS模式與雙光子線掃描結合：
LSS的物理屏障作用：僅曝光照明線鄰近區(qū)域，徹底阻斷散射光子污染，使調制對比度在56μm深度仍滿足超分辨重建需求（>0.1）。
雙光子激發(fā)的天然優(yōu)勢：非線性激發(fā)僅聚焦區(qū)域產生信號，規(guī)避熒光回程散射對成像的影響。
02低成本簡易改裝方案通用性設計：僅需在現(xiàn)有雙光子顯微鏡上加裝柱面鏡（≈$200）、多夫棱鏡（≈$300）和sCMOS相機（≈$15k），無需自適應光學或專用物鏡。
靈活的參數(shù)調控：通過掃描電壓調節(jié)圖案間距，支持40×/1.15NA至100×/1.49NA多種物鏡。
03為活體研究開辟新路徑深度-分辨率平衡：在70μm深度實現(xiàn)150nm分辨率，超越現(xiàn)有技術（如光學光子重分配顯微鏡-OPRA的1.44倍、多焦點結構光照明顯微鏡-MSIM的1.6倍提升）。
多樣本兼容性：成功應用于植物（松木）、哺乳動物（小鼠心臟）和模式生物（斑馬魚），支持肌動蛋白、細胞核等多種熒光標記。
總結與展望
LiL-SIM技術通過創(chuàng)新性地融合雙光子線掃描照明、光場旋轉與LSS檢測模式，為深層生物組織超分辨成像提供了高性價比解決方案。其核心價值在于：首次在無需復雜自適應光學的條件下，將超分辨成像深度推進至70μm，分辨率達150nm，并兼容常規(guī)熒光標記。
當前技術仍受限于掃描速度（需優(yōu)化多夫棱鏡旋轉延時）和光子效率（低雙光子截面染料受限），未來可通過振鏡K鏡替代棱鏡、平頂光束整形進一步提升性能。該技術有望推動神經(jīng)突觸、腫瘤微環(huán)境等深層動態(tài)過程的研究，為生物醫(yī)學領域提供“平民化”超分辨成像工具。
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
Byers P, Kellerer T, Li M, Chen Z, Huser T, Hellerer T. Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation. Nat Commun. 2025 Jun 25;16(1):5386.
DOI:10.1038/s41467-025-60744-y.
