鋅指核酸酶的組成、作用原理和優(yōu)缺點
鋅指核酸酶是一種人工合成的 DNA 結合蛋白，由兩部分構成：
①鋅指 DNA 結合域
來自真核轉錄因子，負責識別并靶向特定的 DNA 序列。鋅指 DNA 結合域由三組鋅指組成，每組鋅指由大約 30 個氨基酸與一個鋅原子相連，分別結合 3 bp 的 DNA 序列。
② DNA 切割域
來自 FokI 限制性內(nèi)切酶，它以二聚體的形式執(zhí)行其功能，分別靶向不同的 DNA 鏈，非特異性切割 5-7 bp 的間隔序列。在設計 ZFN 時可以對 FokI 進行突變，使之形成具有核酸酶活性的異源二聚體，可以增加其對 DNA 序列識別的特異性。
如圖所示，一對串聯(lián)的鋅指 DNA 結合基序將 FokI 的兩個亞基引導至特定基因組位點，對目的 DNA進行切割產(chǎn)生 DSB。需要注意的是，鋅指核酸酶的合成和組裝程序比較復雜且成本較高。
ZFN 結構示意圖
優(yōu)點
- 早期實用性：作為首個成熟的基因編輯技術，為后續(xù)技術（如 TALEN、CRISPR）奠定了基礎。
- 一定特異性：相比早期的隨機突變技術，可實現(xiàn)對特定基因的編輯。
- 設計難度高：鋅指與 DNA 的結合存在 “上下文依賴”—— 單個鋅指的識別受相鄰鋅指影響，難以通過簡單規(guī)則設計，需大量篩選驗證。
- 脫靶風險：部分 ZFNs 可能結合非目標序列，導致脫靶切割，引發(fā)基因突變風險。
- 構建復雜：篩選高效、特異的 ZFNs 耗時費力，成本較高。
- 適用范圍有限：并非所有 DNA 序列都能找到對應的鋅指組合，靶向靈活性較低。
目前 ZFNs 的應用已大幅減少，但在部分領域仍有一席之地：
- 少數(shù)基因治療公司（如 Sangamo Therapeutics）仍在推進基于 ZFNs 的臨床試驗（如血友病治療）；
- 其 “蛋白 - DNA 識別 + 核酸酶切割” 的設計思路，為后續(xù)基因編輯工具的開發(fā)提供了重要參考。
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