基于納米流式檢測技術(shù)的核酸染色策略實(shí)現(xiàn)HCMV與EVs的高效區(qū)分

人巨細(xì)胞病毒（herpesvirus human cytomegalovirus, HCMV）是一種廣泛傳播的皰疹病毒，全球成人中血清陽性率超 60%，可導(dǎo)致免疫功能低下者發(fā)生嚴(yán)重疾病，甚至致命感染。然而，HCMV 致病機(jī)制研究長期受限于核心技術(shù)瓶頸：所有體外培養(yǎng)的病毒制劑中都存在宿主細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），且病毒顆粒與 EVs 在物理和生化性質(zhì)上高度相似。HCMV 感染還會劫持宿主 EV 生物合成通路，導(dǎo)致感染細(xì)胞分泌的 EVs 攜帶晚期結(jié)構(gòu)域序列的病毒蛋白，進(jìn)一步模糊兩者邊界。如果不將病毒顆粒與 EVs 和污染物分離，就無法研究其功能特性。

傳統(tǒng)的分離手段通常是基于物理和生化性質(zhì)差異，很難區(qū)分病毒和 EVs。如密度梯度離心會使病毒與 EVs 共遷移，且沒有有效的手段檢查污染物的存在；由于 EVs 和病毒的蛋白組成存在重疊，磁性捕獲或親和層析等方法并不總是具有選擇性。另一方面，常規(guī)表征方法的缺陷會加劇純化相關(guān)的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致對 EVs 或病毒制劑中污染水平的誤判。ELISA、Western Blotting 和蛋白組學(xué)等方法展示的是所有顆�；旌衔镎�體的集群平均結(jié)果；像電鏡這樣的單顆粒表征方法不易獲取且通量很低；病毒空斑實(shí)驗(yàn)主要檢測功能完整的病毒，無法檢測非感染性病毒顆粒的污染。

近期，帝國理工團(tuán)隊(duì)在 Journal of Extracellular Vesicles 發(fā)表了題為“Nano-Flow Cytometry-Guided Discrimination and Separation of Human Cytomegalovirus Virions and Extracellular Vesicles”的突破性研究。本研究開發(fā)了一種基于納米流式檢測技術(shù)（NanoFCM）的核酸染色策略，首次實(shí)現(xiàn)了從 HCMV 感染細(xì)胞上清的混合物中將病毒顆粒和 EVs 精準(zhǔn)區(qū)分和同步定量分析（圖1），并據(jù)此開發(fā)高效的 HCMV 分離方法，為深入探究 EVs 及病毒相關(guān)的功能性研究開辟了新路徑。

圖1. NanoFCM 對 HCMV、DBs 與 EVs 的定性和定量分析

一、顆粒濃度和粒徑檢測
研究團(tuán)隊(duì)首先利用 NanoFCM 對細(xì)胞上清中的顆粒進(jìn)行無標(biāo)記濃度和粒徑檢測。該方法基于側(cè)向散射信號和單顆粒檢測策略建立：側(cè)向散射強(qiáng)度與顆粒大小成正比，脈沖頻率則反映顆粒濃度。NanoFCM 分析顯示，與未感染細(xì)胞上清相比（圖2A），HCMV 感染細(xì)胞上清具有更多且更強(qiáng)的側(cè)向散射脈沖信號（圖2B），提示 HCMV 感染不僅誘導(dǎo)細(xì)胞分泌顆粒顯著增加，還產(chǎn)生更多大顆粒（圖2C, E）。粒徑分布圖分析進(jìn)一步揭示，未感染組產(chǎn)生的 EVs 粒徑分布主要集中在 50 nm 左右（圖2D）；而 HCMV 感染組，除了 50 nm 的 EVs 主峰外，顆粒粒徑分布范圍明顯擴(kuò)寬，并出現(xiàn)了約 140 nm 的額外峰值（圖2E），該峰值代表 HCMV 病毒顆粒和密集體（dense bodies, DBs）的存在。

圖2. 細(xì)胞上清中顆粒濃度和粒徑檢測

二、核酸染色對顆粒進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別
為了精確區(qū)分 HCMV、DBs 和 EVs，研究團(tuán)隊(duì)采用核酸染料 SYTO 13、SYBR Green I 和 SYBR Safe 對 HCMV 感染細(xì)胞產(chǎn)生的顆粒進(jìn)行染色，以實(shí)現(xiàn)分型和定量。NanoFCM 結(jié)果顯示，未感染組（圖3A）僅檢測到 EVs 群體，而 HCMV 感染組（圖3B）的二維散點(diǎn)圖中可以清晰區(qū)分三個特征性群體，分別是高散射光且高熒光強(qiáng)度的 HCMV，低散射光和不同熒光強(qiáng)度的 EVs，高散射光但較低熒光的 DBs。三種染料所測參數(shù)結(jié)果一致性良好（圖3C），其中 SYBR Green I 對病毒染色效果最佳，其熒光強(qiáng)度更高且背景熒光低，提供了更清晰的分群結(jié)果。此外，研究團(tuán)隊(duì)對兩組細(xì)胞上清中的顆粒進(jìn)行了透射電子顯微鏡（TEM）分析，直觀證實(shí)了未感染組中只有 EVs（圖3D），而 HCMV 感染組中則同時存在大量病毒顆粒、DBs 和 EVs（圖3E），這與 NanoFCM 數(shù)據(jù)高度一致。綜上所述，NanoFCM 可基于顆粒的熒光信號和側(cè)向散射特征，精確區(qū)分 HCMV、DBs 和 EVs，并提供可靠的定量數(shù)據(jù)，為后續(xù)分離技術(shù)的建立奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)。

圖3. NanoFCM 結(jié)合核酸染色對 HCMV、DBs 和 EVs 的鑒別

三、病毒顆粒定量和感染動力學(xué)
為了闡明 HCMV 感染過程中病毒顆粒和 EVs 的動態(tài)變化，研究團(tuán)隊(duì)利用 NanoFCM 對病毒顆粒進(jìn)行定量監(jiān)測。如圖 4 所示，病毒顆粒濃度隨著時間推移顯著增加。同時，NanoFCM 能夠在不同感染復(fù)數(shù)（MOI）條件下準(zhǔn)確量化這一變化過程，且其定量趨勢與 qPCR 結(jié)果一致，驗(yàn)證了 NanoFCM 定量的可靠性。此外，分析不同時間點(diǎn)病毒顆粒的占比發(fā)現(xiàn)，盡管其絕對數(shù)量增加，但其占總顆粒數(shù)量的百分比始終低于 15%。這表明在 HCMV 感染細(xì)胞中，除了病毒顆粒之外，還有大量的非病毒顆粒（如 EVs）被分泌。

圖4. NanoFCM 監(jiān)測病毒感染動力學(xué)

四、NanoFCM 評估病毒與 EVs 的分離方法
為了實(shí)現(xiàn) HCMV、DBs 和 EVs 的有效分離，研究團(tuán)隊(duì)基于它們的密度差異，優(yōu)化了一種基于碘克沙醇墊高速離心的純化方法。采用 SYBR Green I 染色結(jié)合 NanoFCM 對該分離純化方法進(jìn)行評估。高速離心后，NanoFCM 分析顯示 HCMV 和 DBs 主要富集于離心管底部，而 EVs 則富集在上層液體中（圖5）。TEM 表征進(jìn)一步證實(shí)底部沉淀物中含有大量 HCMV 和 DBs，此外，空斑實(shí)驗(yàn)表明該分離過程對病毒的感染性無顯著影響。綜上結(jié)果表明，基于密度墊的高速離心法不僅能夠高效分離 HCMV 和 EVs，還能保持病毒的感染性。

圖5. 密度墊高速離心分離病毒與 EVs

為了進(jìn)一步獲得高純度 EVs 樣本，研究團(tuán)隊(duì)采用尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography, SEC）去除上清中殘留的 HCMV 和 DBs。TEM 成像顯示（圖6A, B），經(jīng) SEC 純化后，未感染組和 HCMV 感染組的 EVs 形態(tài)無明顯差異，且未觀察到 HCMV 和 DBs 存在。NanoFCM 分析（圖6C, D）進(jìn)一步證實(shí)了純化后的 EVs 樣本幾乎沒有病毒顆粒污染，EVs 純度可達(dá) 96%。此外，研究發(fā)現(xiàn) HCMV 感染組 EVs 產(chǎn)量（3.53×1012）顯著高于未感染組產(chǎn)量（1.43×1012），且兩組分泌的 EVs 粒徑分布存在差異。EVs 表面標(biāo)志物 CD81 分析顯示，未感染組 CD81 陽性 EVs 占比為 23%，而感染組則升高至 38.5%（圖6E, F）。這些結(jié)果表明，HCMV 感染可能改變 EVs 的生發(fā)途徑。

圖6. 經(jīng) SEC 純化后 EVs 的表征

總 結(jié)
本研究基于 NanoFCM 平臺創(chuàng)新性地開發(fā)了一種核酸染色技術(shù)方案，首次在單顆粒水平實(shí)現(xiàn)了對 HCMV、DBs 與 EVs 的精準(zhǔn)區(qū)分與同步定量分析。進(jìn)一步結(jié)合碘克沙醇墊離心與 SEC 純化，建立了一套高效的病毒（HCMV/DBs）與 EVs 分離流程。這些技術(shù)突破不僅為 HCMV 相關(guān)研究奠定了關(guān)鍵方法學(xué)基礎(chǔ)，也為深入探索 EVs 生物學(xué)及病毒-EVs 相互作用提供了全新的技術(shù)平臺。所構(gòu)建的“鑒別-分離-驗(yàn)證”技術(shù)體系具有普適性，可拓展應(yīng)用于其他病毒及納米顆粒研究。該研究對于推動病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的交叉融合具有重要意義，并在病毒載體開發(fā)、EVs 的靶向遞送以及臨床感染的精準(zhǔn)監(jiān)測等多領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的科學(xué)價值和應(yīng)用前景。

展 望
NanoFCM 憑借其極高的靈敏度，其散射通道能夠檢測低至 24 nm 二氧化硅顆粒，熒光通道則能實(shí)現(xiàn)單個核酸、單個抗體或單個藻紅蛋白的定量分析。相較于傳統(tǒng)的 qPCR 和 TEM 技術(shù)，NanoFCM 可在極短的時間內(nèi)提供單顆粒水平的理化和生化定量信息，同時避免了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的集群檢測，從而顯著提升研究效率和結(jié)果的精準(zhǔn)度。結(jié)合核酸染色或免疫熒光標(biāo)記策略，該技術(shù)能夠精準(zhǔn)區(qū)分并準(zhǔn)確定量復(fù)雜混合物中的不同顆粒類型。此外，其純度分析功能有效評估和優(yōu)化分離純化方案，提高目標(biāo)產(chǎn)物的回收率及純度。隨著研究的深入，NanoFCM 有望在病毒學(xué)、納米藥物研發(fā)以及個性化醫(yī)療等領(lǐng)域發(fā)揮更為重要的作用。