dTAG蛋白降解分析：針對(duì)靶蛋白的選擇性降解
引言
靶向蛋白質(zhì)降解是一種新策略，旨在出于治療目的，從細(xì)胞中選擇性地消除特定蛋白質(zhì)。雖然最初這項(xiàng)研究主要關(guān)注 PROTAC 分子，但如今，新的靶向降解方法正在涌現(xiàn)。其中之一就是降解 TAG （dTAG） 技術(shù)。
dTAG是一種創(chuàng)新的靶標(biāo)驗(yàn)證方法。像PROTACs一樣，該方法使用一種異雙功能小分子，建立目標(biāo)蛋白與E3泛素連接酶之間的三元復(fù)合物。然而，dTAG技術(shù)的獨(dú)特之處在于，通過(guò)CRISPR/Cas9將雙功能降解劑的一部分結(jié)合位點(diǎn)人工引入到目標(biāo)蛋白中，這使得dTAG成為進(jìn)行靶標(biāo)驗(yàn)證研究、探討劑量依賴效應(yīng)的理想工具。
本文所述的dTAG蛋白降解分析使用了雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)測(cè)量靶蛋白降解。為此，使用螢火蟲熒光素酶作為基準(zhǔn)標(biāo)記物，該標(biāo)記物不應(yīng)受到dTAG降解的影響。第二種熒光素酶是納米熒光素酶（Nanoluciferase），以碎片化的非活性形式（HiBiT）與靶蛋白融合。dTAG降解劑能夠通過(guò)引入的dTAG結(jié)合基序，將靶蛋白與E3泛素連接酶結(jié)合，從而形成三元復(fù)合物（見(jiàn)圖1）。這會(huì)導(dǎo)致靶蛋白及其融合的HiBiT片段的泛素化并隨之降解。為了測(cè)量納米熒光素酶的熒光發(fā)射，在降解后加入LgBiT。這個(gè)小的納米熒光素酶片段可以完成未降解的HiBiT片段，進(jìn)而形成活性納米熒光素酶，產(chǎn)生熒光信號(hào)。納米熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的發(fā)射比值則成為dTAG降解劑效能的指示，比例越低，目標(biāo)降解程度越高。
圖 1：dTAG 蛋白質(zhì)降解測(cè)定原理
研究目標(biāo)
本研究旨在通過(guò)對(duì)dTAG結(jié)構(gòu)進(jìn)行修改，改善已知dTAG支架的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。為此，研究人員將dTAG降解劑或DMSO對(duì)照物分配到1536孔iSTAR微孔板的孔中。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSBTK-HiBiT-dTAG-TargetX-P2A-Fluc-T2A-Puro質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞單層從培養(yǎng)瓶中分離，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)過(guò)1400rpm離心4分鐘后，去除上清液，再將細(xì)胞沉淀重懸在含有2%胎牛血清的OPTIMEM培養(yǎng)基中。每孔加入2.5 µL細(xì)胞懸液。微孔板經(jīng)過(guò)短暫離心后，在5% CO2、37°C環(huán)境下孵育4小時(shí)。每孔加入2.5 µL OneGlo試劑后，經(jīng)過(guò)10分鐘孵育和300rpm震蕩，使用PHERAstar FSX讀取螢火蟲熒光素酶的發(fā)射。隨后，每孔加入2.5 µL StopGlo試劑、0.025 µL納米熒光素酶底物和1/100 LgBiT，酶標(biāo)儀經(jīng)過(guò)1分鐘離心后，再次使用PHERAstar FSX讀取納米熒光素酶的化學(xué)發(fā)光。
dTAG 分解酶的評(píng)估
測(cè)試多種dTAG降解劑誘導(dǎo)HiBiT靶向降解的能力。為此，將降解劑dTAG-v2、dTAG-47和dTAG-13以遞增濃度（0.1至10,000 nM）加入表達(dá)HiBiT的細(xì)胞中，并使用1536孔酶標(biāo)儀（圖2）。
圖 2：dTAG 蛋白質(zhì)降解測(cè)試：測(cè)試了三種 dTAG 降解劑誘導(dǎo)靶向 HiBiT 降解的能力。將濃度為 0.1 至 10,000 nM 的 dTAG 降解劑添加到穩(wěn)定表達(dá) HiBiT 融合蛋白的 HEK 細(xì)胞培養(yǎng)物中。4 小時(shí)后，依次測(cè)量了螢火蟲螢光素酶和納米螢光素酶的化學(xué)發(fā)光
所有測(cè)試的dTAG降解劑均以濃度依賴的方式引起了納米熒光素酶發(fā)射量的下降（即HiBiT降解）。然而，不同的dTAG分子在HiBiT降解的程度上有所不同。dTAG-13（綠色曲線）引起約50%的降解和納米熒光素酶發(fā)射量的減少，而dTAG-v1（藍(lán)色曲線）則表現(xiàn)為最強(qiáng)的降解劑，幾乎完全降解了HiBiT。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步評(píng)估了dTAG-v1降解劑的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性（見(jiàn)圖3）。在此實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估了1到10 µM濃度范圍的dTAG-v1，并進(jìn)行了32次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與DMSO對(duì)照組進(jìn)行了比較。
圖3：dTAG-v1的評(píng)估：1到10 µM的dTAG-v1應(yīng)用于穩(wěn)定表達(dá)HiBiT融合蛋白的HEK細(xì)胞，并進(jìn)行了32次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用DMSO處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。計(jì)算dTAG-v1 HiBiT信號(hào)的信號(hào)與空白比值（S/B值）以及 Z prime ，以評(píng)估數(shù)據(jù)穩(wěn)定性
如圖 3 所示，與 DMSO 對(duì)照相比，所有三種濃度的 dTAG-v1 均導(dǎo)致 HiBiT 融合蛋白降解。信號(hào)與空白比值顯示，納米熒光蛋白化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨濃度降低而降低，而 Z 因子為 0.84 至 0.87，表明數(shù)據(jù)穩(wěn)定性良好。
結(jié)論
使用 dTAG 蛋白質(zhì)降解檢測(cè)，測(cè)試的 dTAG 分子可成功用于誘導(dǎo) HiBiT 融合蛋白質(zhì)復(fù)合物的靶向降解。由于其高靈敏度、快速讀取時(shí)間和縮小規(guī)模的兼容性，PHERAstar FSX 非常適合此應(yīng)用，與 iSTAR 板一起使用，性能與類似的酶標(biāo)儀相當(dāng)。
圖 4：PHERAstar FSX 酶標(biāo)儀
轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH
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