從CNS洞見單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在免疫、干細(xì)胞分化、發(fā)育中的應(yīng)用
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組是一項(xiàng)新興的技術(shù)，正處于蓬勃發(fā)展的時(shí)期。它可以揭示生命體內(nèi)功能的真正執(zhí)行者——蛋白質(zhì)水平的變化，而引起了眾多科研人員的關(guān)注。但是也因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)剛剛起步，大家對(duì)于如何應(yīng)用，如何解決科學(xué)問題還抱有疑惑。因此，今天小編來跟大家分享一下單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在免疫、干細(xì)胞分化、發(fā)育三個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，以期能給大家提供一些思路及靈感。
一、干細(xì)胞分化——單細(xì)胞組學(xué)揭示原發(fā)性急性髓系白血病干細(xì)胞分化過程
文獻(xiàn)名稱：Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchie
發(fā)表期刊：Nature Communications（IF 14.919）
樣本類型：原發(fā)性急性髓系白血病細(xì)胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群；
· 步驟2：比較不同細(xì)胞群之間的蛋白質(zhì)差異，并發(fā)現(xiàn)分化的連續(xù)性；
· 步驟3：擬時(shí)序分析尋找驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。
主要內(nèi)容：
1. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可對(duì)不同分化階段的細(xì)胞進(jìn)行分群
通過流式分選白血病干細(xì)胞分化的三個(gè)階段的細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析�；阼b定到的1790個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行降維分析，可以清晰地分離三個(gè)已知的分化階段，再現(xiàn)了FACS分析的結(jié)果。
一、干細(xì)胞分化——單細(xì)胞組學(xué)揭示原發(fā)性急性髓系白血病干細(xì)胞分化過程
文獻(xiàn)名稱：Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchie
發(fā)表期刊：Nature Communications（IF 14.919）
樣本類型：原發(fā)性急性髓系白血病細(xì)胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群；
· 步驟2：比較不同細(xì)胞群之間的蛋白質(zhì)差異，并發(fā)現(xiàn)分化的連續(xù)性；
· 步驟3：擬時(shí)序分析尋找驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。
主要內(nèi)容：
1. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可對(duì)不同分化階段的細(xì)胞進(jìn)行分群
通過流式分選白血病干細(xì)胞分化的三個(gè)階段的細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析�；阼b定到的1790個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行降維分析，可以清晰地分離三個(gè)已知的分化階段，再現(xiàn)了FACS分析的結(jié)果。
圖1-1 細(xì)胞分群結(jié)果
2. 同一類型細(xì)胞間蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)差異性
將Blasts和其他細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行比較，從而鑒定到了Blasts和LSC與PROG的差異表達(dá)蛋白。有趣的是，這些差異蛋白在同一分化階段也呈現(xiàn)不一樣的表達(dá)，表明同一細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)表達(dá)是有差異的，即細(xì)胞分化是個(gè)連續(xù)性的過程，并且是由一些特定的蛋白質(zhì)信號(hào)驅(qū)動(dòng)的。這是在bulk組學(xué)中無法發(fā)現(xiàn)的。
圖1-3 擬時(shí)序分析
圖2-2 巨噬細(xì)胞極化呈連續(xù)性
圖2-3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析
三、發(fā)育——單細(xì)胞組學(xué)揭示小鼠性腺發(fā)育過程
文獻(xiàn)名稱：Dissecting Cell Lineage Specification and Sex Fate Determination in Gonadal Somatic Cells Using Single-Cell Transcriptomics
發(fā)表期刊：Cell Reports（IF 9.432）
研究背景：卵巢和睪丸具有相同的發(fā)育起源，在發(fā)育過程中出現(xiàn)兩性的區(qū)別，而對(duì)于在性別決定前性腺細(xì)胞譜系知之甚少。
樣本類型：Tg（Nr5a1-GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠性腺
研究思路：
· 步驟1：對(duì)來自于六個(gè)階段的體細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析并進(jìn)行細(xì)胞分群；
· 步驟2：通過擬時(shí)序分析研究雌性體細(xì)胞發(fā)育過程；
· 步驟3：比較雌性和雄性的細(xì)胞分化過程，證明性別二態(tài)性。
主要內(nèi)容：
1. 體細(xì)胞可分為四個(gè)細(xì)胞群體
從六個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因小鼠性腺中，基于熒光蛋白的表達(dá)分選出體細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測，總共有563個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。根據(jù)這563個(gè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)，分成了四個(gè)細(xì)胞簇，基于marker基因及每個(gè)簇基因表達(dá)的特異性對(duì)細(xì)胞簇進(jìn)行定義，分別為早期和基質(zhì)祖細(xì)胞，前顆粒細(xì)胞和出生后顆粒細(xì)胞。并通過GO分析對(duì)四個(gè)細(xì)胞群體的功能進(jìn)行注釋。
圖3-1 早期卵巢發(fā)育過程中性腺體細(xì)胞的分類
2. 建立雌性體細(xì)胞發(fā)育譜系
接下來通過擴(kuò)散圖模擬了細(xì)胞的分化趨勢，建立了細(xì)胞發(fā)育譜系。結(jié)果顯示顆粒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是從一個(gè)共同的祖細(xì)胞群分化而來。沿著擬時(shí)序?qū)?xì)胞進(jìn)行排序，繪制隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜，根據(jù)表達(dá)模式將基因分類，并進(jìn)行GO注釋，找到關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)分化的基因。
圖3-2 早期卵巢發(fā)育過程中性腺體細(xì)胞的分化
3. 細(xì)胞分化呈現(xiàn)性別二態(tài)性
建立了雌性性腺的發(fā)育圖譜后，又將數(shù)據(jù)與過去的來自雄性性腺的400個(gè)體細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，進(jìn)行降維聚類，以及擬時(shí)序分析，證明了從D2細(xì)胞起細(xì)胞的分化開始出現(xiàn)性別差異，證明了性別二態(tài)性。這個(gè)文章就是通過單細(xì)胞組學(xué)進(jìn)行降維及擬時(shí)序分析，研究細(xì)胞的分化過程。
圖3-3 兩種性別的細(xì)胞分化過程比較
研究思路總結(jié)
根據(jù)以上文獻(xiàn)可知，現(xiàn)在的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分群，細(xì)胞功能的注釋以及細(xì)胞的分化等研究，從蛋白質(zhì)水平上去解決細(xì)胞的異質(zhì)性的科學(xué)問題，推薦的研究思路如下：
圖1-2 差異蛋白的表達(dá)
3. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可進(jìn)行分化軌跡分析
基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬時(shí)序分析，結(jié)果顯示細(xì)胞的分化軌跡與FACS數(shù)據(jù)一致，LSC位于頂點(diǎn)，分化產(chǎn)生了Blasts和PROG。但又發(fā)現(xiàn)CD38+和CD38-Blasts細(xì)胞沿著軌跡輕微分離，說明可能存在兩條平行的分化路徑。接下來繪制了沿著偽時(shí)間的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，揭示了驅(qū)動(dòng)細(xì)胞排序的主要因素。
基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬時(shí)序分析，結(jié)果顯示細(xì)胞的分化軌跡與FACS數(shù)據(jù)一致，LSC位于頂點(diǎn)，分化產(chǎn)生了Blasts和PROG。但又發(fā)現(xiàn)CD38+和CD38-Blasts細(xì)胞沿著軌跡輕微分離，說明可能存在兩條平行的分化路徑。接下來繪制了沿著偽時(shí)間的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，揭示了驅(qū)動(dòng)細(xì)胞排序的主要因素。
圖1-3 擬時(shí)序分析
二、免疫——單細(xì)胞多組學(xué)聯(lián)合解析巨噬細(xì)胞異質(zhì)性
文獻(xiàn)名稱：Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2
發(fā)表期刊：Genome Biology（13.583）
研究背景：巨噬細(xì)胞是具有不同功能和分子表型的先天免疫細(xì)胞，但這種多樣性在單細(xì)胞蛋白質(zhì)水平上尚未進(jìn)行深入研究。
樣本類型：PMA激活的單核細(xì)胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群；
· 步驟2：通過分析蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞存在異質(zhì)性；
· 步驟3：聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)比較RNA和蛋白質(zhì)的共性及差異性。
主要內(nèi)容：
1. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可進(jìn)行細(xì)胞分群
用PMA激活單核細(xì)胞的分化后，分選出1490個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，總共鑒定到3042個(gè)蛋白質(zhì)。通過PCA分析可將細(xì)胞分成兩個(gè)主要離散的細(xì)胞簇，根據(jù)細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)可將兩個(gè)細(xì)胞簇分別對(duì)應(yīng)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。與bulk蛋白質(zhì)組學(xué)相比，相關(guān)性為0.88，說明單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。
文獻(xiàn)名稱：Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2
發(fā)表期刊：Genome Biology（13.583）
研究背景：巨噬細(xì)胞是具有不同功能和分子表型的先天免疫細(xì)胞，但這種多樣性在單細(xì)胞蛋白質(zhì)水平上尚未進(jìn)行深入研究。
樣本類型：PMA激活的單核細(xì)胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群；
· 步驟2：通過分析蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞存在異質(zhì)性；
· 步驟3：聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)比較RNA和蛋白質(zhì)的共性及差異性。
主要內(nèi)容：
1. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可進(jìn)行細(xì)胞分群
用PMA激活單核細(xì)胞的分化后，分選出1490個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，總共鑒定到3042個(gè)蛋白質(zhì)。通過PCA分析可將細(xì)胞分成兩個(gè)主要離散的細(xì)胞簇，根據(jù)細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)可將兩個(gè)細(xì)胞簇分別對(duì)應(yīng)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。與bulk蛋白質(zhì)組學(xué)相比，相關(guān)性為0.88，說明單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。
圖2-1 基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞分群
2. 巨噬細(xì)胞間呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性
為了研究同質(zhì)單核細(xì)胞是否會(huì)分化為同質(zhì)巨噬細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的Fiedler向量值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督光譜分析，表征細(xì)胞異質(zhì)性。單核細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白質(zhì)主要與增殖相關(guān)，包括染色質(zhì)組織和翻譯；巨噬細(xì)胞中富含細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白，與細(xì)胞本身的生物功能一致。對(duì)巨噬細(xì)胞群體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)連續(xù)性變化，先前鑒定為M1和M2極化的人原代巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白質(zhì)也在巨噬細(xì)胞之間差異表達(dá)。
為了研究同質(zhì)單核細(xì)胞是否會(huì)分化為同質(zhì)巨噬細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的Fiedler向量值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督光譜分析，表征細(xì)胞異質(zhì)性。單核細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白質(zhì)主要與增殖相關(guān)，包括染色質(zhì)組織和翻譯；巨噬細(xì)胞中富含細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白，與細(xì)胞本身的生物功能一致。對(duì)巨噬細(xì)胞群體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)連續(xù)性變化，先前鑒定為M1和M2極化的人原代巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白質(zhì)也在巨噬細(xì)胞之間差異表達(dá)。
圖2-2 巨噬細(xì)胞極化呈連續(xù)性
3. 單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組呈現(xiàn)差異性
為了研究RNA和蛋白質(zhì)水平的相似性和差異，利用來自相同生物學(xué)重復(fù)的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，與單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)的相關(guān)性呈現(xiàn)雙峰分布，即RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平既具有共變基因（簇1），也具有呈相反的基因（簇2）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白組的數(shù)據(jù)更加緊湊，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)更加分散，表明RNA檢測中存在更大的生物學(xué)和技術(shù)變異性。
為了研究RNA和蛋白質(zhì)水平的相似性和差異，利用來自相同生物學(xué)重復(fù)的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，與單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)的相關(guān)性呈現(xiàn)雙峰分布，即RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平既具有共變基因（簇1），也具有呈相反的基因（簇2）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白組的數(shù)據(jù)更加緊湊，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)更加分散，表明RNA檢測中存在更大的生物學(xué)和技術(shù)變異性。
圖2-3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析
三、發(fā)育——單細(xì)胞組學(xué)揭示小鼠性腺發(fā)育過程
文獻(xiàn)名稱：Dissecting Cell Lineage Specification and Sex Fate Determination in Gonadal Somatic Cells Using Single-Cell Transcriptomics
發(fā)表期刊：Cell Reports（IF 9.432）
研究背景：卵巢和睪丸具有相同的發(fā)育起源，在發(fā)育過程中出現(xiàn)兩性的區(qū)別，而對(duì)于在性別決定前性腺細(xì)胞譜系知之甚少。
樣本類型：Tg（Nr5a1-GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠性腺
研究思路：
· 步驟1：對(duì)來自于六個(gè)階段的體細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析并進(jìn)行細(xì)胞分群；
· 步驟2：通過擬時(shí)序分析研究雌性體細(xì)胞發(fā)育過程；
· 步驟3：比較雌性和雄性的細(xì)胞分化過程，證明性別二態(tài)性。
主要內(nèi)容：
1. 體細(xì)胞可分為四個(gè)細(xì)胞群體
從六個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因小鼠性腺中，基于熒光蛋白的表達(dá)分選出體細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測，總共有563個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。根據(jù)這563個(gè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)，分成了四個(gè)細(xì)胞簇，基于marker基因及每個(gè)簇基因表達(dá)的特異性對(duì)細(xì)胞簇進(jìn)行定義，分別為早期和基質(zhì)祖細(xì)胞，前顆粒細(xì)胞和出生后顆粒細(xì)胞。并通過GO分析對(duì)四個(gè)細(xì)胞群體的功能進(jìn)行注釋。
圖3-1 早期卵巢發(fā)育過程中性腺體細(xì)胞的分類
2. 建立雌性體細(xì)胞發(fā)育譜系
接下來通過擴(kuò)散圖模擬了細(xì)胞的分化趨勢，建立了細(xì)胞發(fā)育譜系。結(jié)果顯示顆粒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是從一個(gè)共同的祖細(xì)胞群分化而來。沿著擬時(shí)序?qū)?xì)胞進(jìn)行排序，繪制隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜，根據(jù)表達(dá)模式將基因分類，并進(jìn)行GO注釋，找到關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)分化的基因。
圖3-2 早期卵巢發(fā)育過程中性腺體細(xì)胞的分化
3. 細(xì)胞分化呈現(xiàn)性別二態(tài)性
建立了雌性性腺的發(fā)育圖譜后，又將數(shù)據(jù)與過去的來自雄性性腺的400個(gè)體細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，進(jìn)行降維聚類，以及擬時(shí)序分析，證明了從D2細(xì)胞起細(xì)胞的分化開始出現(xiàn)性別差異，證明了性別二態(tài)性。這個(gè)文章就是通過單細(xì)胞組學(xué)進(jìn)行降維及擬時(shí)序分析，研究細(xì)胞的分化過程。
圖3-3 兩種性別的細(xì)胞分化過程比較
研究思路總結(jié)
根據(jù)以上文獻(xiàn)可知，現(xiàn)在的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分群，細(xì)胞功能的注釋以及細(xì)胞的分化等研究，從蛋白質(zhì)水平上去解決細(xì)胞的異質(zhì)性的科學(xué)問題，推薦的研究思路如下：
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