PCR 反應(yīng)引物應(yīng)具有特點(diǎn)介紹

PCR 反應(yīng)引物應(yīng)具有特點(diǎn)：
1、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)te性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2、選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
3、設(shè)計5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
4、避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
5、避免3'末端富含GC。設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。
6、 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7、避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。

有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設(shè)計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌lìng可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因?yàn)?'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。