PCR反應擴增產物出現多條帶現象解析
聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段。PCR反應由一系列的變性→退火→延伸反復循環(huán)構成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上，經過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經25到30次循環(huán)可擴增到106倍，足夠后續(xù)實驗展開。
擴增產物出現多條帶(雜帶)：
1、 引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
2、循環(huán)的次數過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數。
3、 酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
4、退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。
5、 樣品處理不當。
6、 Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
7、 若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
8、 復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。
9、 反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并全混勻。
10、 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
11、 引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
12、 模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
13、 外源DNA污染。確保操作的潔凈。
