PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）特異性決定因素及提高方式
PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。
PCR反應(yīng)特異性主要決定因素：
1、引物。引物的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度是PCR特異性的關(guān)鍵。此外，引物濃度過(guò)高會(huì)增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性。
2、復(fù)性溫度。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。
3、延伸時(shí)間。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。
4、Mg2+濃度。Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過(guò)高時(shí)，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使反應(yīng)特異性降低。
5、DNA聚合酶的種類(lèi)和數(shù)量。不同種類(lèi)的酶對(duì)PCR特異性的影響程度不同；酶的量過(guò)多更容易引起非特異性擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng)特異性提高方式：
1. 引物的設(shè)計(jì)
引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超過(guò)連續(xù)三個(gè) G 或 C，堿基分。
布錯(cuò)落有致，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計(jì)完成之后，需進(jìn)行 BLAST 檢測(cè)，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
2. 降落 PCR
降落 PCR 是一種簡(jiǎn)單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，同時(shí)又可以?xún)?yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度，退火溫度過(guò)高會(huì)使 PCR 效率過(guò)低，過(guò)低則會(huì)使非特異擴(kuò)增過(guò)多。這雖然可以通過(guò)反復(fù)嘗試來(lái)優(yōu)化，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落 PCR 提供了一個(gè)較為簡(jiǎn)易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒(méi)有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會(huì)逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，因此會(huì)對(duì)非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。
3. 熱啟動(dòng)擴(kuò)增
采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行擴(kuò)增，是除了設(shè)計(jì)最佳引物之外，提高 PCR 反應(yīng)特異性好的方式。在一般的 PCR 反應(yīng)中，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將 PCR 儀預(yù)熱，這種方法就類(lèi)似于熱啟動(dòng)，能夠一定程度的抑制錯(cuò)配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在，就會(huì)擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動(dòng)的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui有效的方法就是使用熱啟動(dòng) Taq 酶(或熱啟動(dòng)高保真聚合酶)去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到 95℃時(shí)恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。
4. 巢式 PCR
采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是，它采用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，首先用第一對(duì)引物普通 PCR，然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對(duì)引物(巢式引物)二次擴(kuò)增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
PCR反應(yīng)特異性主要決定因素：
1、引物。引物的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度是PCR特異性的關(guān)鍵。此外，引物濃度過(guò)高會(huì)增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性。
2、復(fù)性溫度。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。
3、延伸時(shí)間。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。
4、Mg2+濃度。Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過(guò)高時(shí)，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使反應(yīng)特異性降低。
5、DNA聚合酶的種類(lèi)和數(shù)量。不同種類(lèi)的酶對(duì)PCR特異性的影響程度不同；酶的量過(guò)多更容易引起非特異性擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng)特異性提高方式：
1. 引物的設(shè)計(jì)
引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超過(guò)連續(xù)三個(gè) G 或 C，堿基分。
布錯(cuò)落有致，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計(jì)完成之后，需進(jìn)行 BLAST 檢測(cè)，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
2. 降落 PCR
降落 PCR 是一種簡(jiǎn)單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，同時(shí)又可以?xún)?yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度，退火溫度過(guò)高會(huì)使 PCR 效率過(guò)低，過(guò)低則會(huì)使非特異擴(kuò)增過(guò)多。這雖然可以通過(guò)反復(fù)嘗試來(lái)優(yōu)化，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落 PCR 提供了一個(gè)較為簡(jiǎn)易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒(méi)有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會(huì)逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，因此會(huì)對(duì)非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。
3. 熱啟動(dòng)擴(kuò)增
采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行擴(kuò)增，是除了設(shè)計(jì)最佳引物之外，提高 PCR 反應(yīng)特異性好的方式。在一般的 PCR 反應(yīng)中，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將 PCR 儀預(yù)熱，這種方法就類(lèi)似于熱啟動(dòng)，能夠一定程度的抑制錯(cuò)配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在，就會(huì)擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動(dòng)的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui有效的方法就是使用熱啟動(dòng) Taq 酶(或熱啟動(dòng)高保真聚合酶)去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到 95℃時(shí)恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。
4. 巢式 PCR
采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是，它采用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，首先用第一對(duì)引物普通 PCR，然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對(duì)引物(巢式引物)二次擴(kuò)增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
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