WGBS+RNA-seq助力揭示植物不定根再生的DNA甲基化調(diào)控機制
植物由于不能移動，會受諸如風(fēng)、雪和動物等逆境脅迫，這些脅迫可能會破壞植物結(jié)構(gòu)，因此再生能力對于植物生存至關(guān)重要。近日，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李云教授團隊探索了植物刺槐（Robinia pseudoacacia L.）的不定根（Adventitious Roots, ARs）再生過程中DNA低甲基化（Hypomethylation）對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用。研究通過使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine, 5-azaC）處理刺槐下胚軸切段，通過全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)，揭示了低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，進而顯著增強不定根再生能力。相關(guān)研究成果以《DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots》為題發(fā)表于《Plant Cell Environ》期刊。
標(biāo)題：DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots（DNA低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，以增強不定根再生）
發(fā)表時間：2025年2月
發(fā)表期刊：Plant Cell Environ
影響因子：IF6.3/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq
作者單位：北京林業(yè)大學(xué)李云等
DOI：10.1111/pce.15236
本研究利用5-azaC DNA甲基化抑制劑，使根原基的啟動和發(fā)育更早發(fā)生，從而提高刺槐的不定根再生率。WGBS揭示了在5-azaC處理樣本中，整體甲基化水平下降，而在所有背景（包括CHH、CHG和mergedCG）中，低甲基化胞嘧啶位點和區(qū)域增加，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變異。酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）實驗揭示了一個以RpMYB2為中心的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子被RpWRKY23、RpGATA23、RpSPL16以及其他基因如RpSDP、RpSS1、RpBEN1、RpGULL05和RpCUV轉(zhuǎn)錄激活，其核定位表明它們可能共定位。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）實驗揭示RpMYB2互作蛋白RpGATA23、RpWRKY23與RpSK6、RpCDC48的啟動子互作，而熒光素酶報告基因?qū)嶒灒↙uciferase Reporting Assay, LRA）驗證了其與RpSK6結(jié)合。本研究結(jié)果表明，低甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組修飾激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，從而增強了刺槐下胚軸切段的不定根再生能力。這些發(fā)現(xiàn)為通過遺傳改良提高植物再生能力和增加木材產(chǎn)量，同時抵御環(huán)境損害提供了理論基礎(chǔ)。
研究方法
- 植物材料收集與再生：使用刺槐種子萌發(fā)后的下胚軸切段作為實驗材料，分別在含和不含5-azaC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察不定根再生情況。
- 石蠟切片與解剖分析：對處理和未處理的切段進行石蠟切片，觀察不定根原基的啟動和發(fā)育過程。
- WGBS分析：分析全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平。
- RNA-seq分析：分析基因表達差異。
- 實時定量PCR（qRT-PCR）驗證：對RNA-seq結(jié)果中差異表達的基因進行驗證。
- 酵母雙雜交（Y2H）和酵母單雜交（Y1H）實驗：鑒定與RpMYB2互作蛋白，以及這些蛋白與下游基因啟動子的結(jié)合情況。
- 熒光素酶報告基因?qū)嶒灒↙RA）：驗證特定轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因啟動子的結(jié)合。
- 亞細(xì)胞定位分析：通過共聚焦顯微鏡觀察關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞中的定位。
結(jié)果圖形
（1）不定根原基的啟動與發(fā)育
研究通過石蠟切片觀察了5-azaC處理和未處理切段的不定根原基啟動和發(fā)育過程。從8日齡幼苗的下胚軸切取1cm長的切段作為外植體，并在切割后的五個時間點（包括切割后的第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，分別標(biāo)記為D0、D1、D2、D3和D4）進行橫截面分析。通過在不同時間點的組織學(xué)對比區(qū)分對照組（D1C、D2C、D3C、D4C）和5-azaC處理組（D1T、D2T、D3T、D4T）外植體中原基的發(fā)育進程以及根分生組織的增殖情況。結(jié)果顯示，5-azaC處理顯著加速了不定根原基的啟動和發(fā)育，處理組在第4天即可觀察到不定根的形成，而對照組則未能發(fā)育出完整的不定根（圖1）。這表明5-azaC通過促進細(xì)胞分裂和分化，顯著增強了不定根的再生能力。
圖1：不定根形成及橫切切段的解剖學(xué)研究。
(a) 1cm長的下胚軸切段放置在含和不含5-azaC培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征。(b) 每段不定根數(shù)量。
(c) 下胚軸切段的解剖結(jié)構(gòu)顯示了不定根原基的啟動和發(fā)育。與對照組相比，處理組（D2T）的不定根原基啟動更早。在（D3T）中形成了根冠，而在（D4T）中原基發(fā)展為功能性不定根，但在（D3C，D4C）中，根分生組織未能發(fā)育。
（2）全基因組甲基化圖譜與不定根再生能力
通過WGBS分析，研究發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著降低了基因組整體甲基化水平，尤其是在CHH、CHG和mergedCG三種序列背景下。在基因組的不同區(qū)域（包括啟動子、基因體和終止子下游區(qū)域），處理組的甲基化水平均顯著低于對照組，尤其是在CHH背景下，甲基化水平降低更為顯著（圖2a-c）。這表明低甲基化可能通過影響基因表達調(diào)控來增強不定根的再生能力。
圖2：5-azaC處理介導(dǎo)全基因組低甲基化。
在5-azaC處理和對照樣本中，第2天和第4天的基因及其±2kb區(qū)域CHH背景（a）、CHG背景（b）和mergedCG背景（c）中的DNA甲基化水平變化。在CHH背景（d）、CGH背景（e）和mergedCG背景（f）中，不同基因組元件（包括啟動子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化位點（DMCs）數(shù)量。在CHH背景（g）、CGH背景（h）和mergedCG背景（i）中，不同基因組元件（包括啟動子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）數(shù)量。（3）低甲基化位點和區(qū)域激活與不定根再生相關(guān)的基因
研究通過分析差異甲基化位點（DMCs）和差異甲基化區(qū)域（DMRs），發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著增加了基因調(diào)控區(qū)域的低甲基化位點和區(qū)域數(shù)量。特別是在啟動子區(qū)域，低甲基化的DMCs和DMRs數(shù)量顯著多于高甲基化的情況（圖2d-i）。這些低甲基化位點和區(qū)域與不定根再生相關(guān)的基因表達激活密切相關(guān)，如RpMYB2、RpWRKY23等基因在低甲基化后表達顯著上調(diào)。
（4）轉(zhuǎn)錄組分析鑒定5-azaC處理激活的基因及低甲基化RpMYB2的潛在互作因子
RNA-seq分析顯示，5-azaC處理顯著改變了基因表達譜，特別是在處理4天后，差異表達基因數(shù)量顯著增加。這些差異表達基因主要包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程（圖3）。其中，低甲基化激活的基因如RpMYB2、RpWRKY23等在不定根再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且這些基因可能通過與其他基因互作來調(diào)控不定根再生。
圖3：DNA低甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組變化，從而引起基因差異表達。
火山圖展示了D2C與D2T組（a）以及D4C與D4T組（b）之間的差異表達基因（DEGs）。熱圖描繪了D2C與D2T組（c）以及D4C與D4T組（d）之間的差異表達基因。所選上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的相對表達量（e）。（5）酵母雙雜交實驗揭示低甲基化RpMYB2在增強生根能力的基因互作網(wǎng)絡(luò)中的中心地位
酵母雙雜交實驗結(jié)果表明，低甲基化激活的RpMYB2是基因互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點，與多個轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白相互作用，如RpGATA23、RpWRKY23、RpSDP等（圖4）。這些相互作用蛋白在不定根再生過程中發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。
圖4：通過酵母雙雜交實驗檢測蛋白-蛋白互作。展示RpMYB2和RpSDP蛋白與其他蛋白的正向互作。
（6）酵母單雜交實驗揭示以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)的進一步見解）
酵母單雜交實驗進一步驗證了RpMYB2互作蛋白與下游基因啟動子的結(jié)合情況。實驗發(fā)現(xiàn)，RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6和RpCDC48的啟動子結(jié)合，表明這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達來增強不定根的再生能力（圖5A）。
圖5：通過酵母單雜交和熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯠NA-蛋白互作。
- 酵母單雜交（Y1H）展示了不同轉(zhuǎn)錄因子與RpSK6和RpCDC48啟動子之間的相互作用。
- 熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示轉(zhuǎn)錄因子RpWRKY23和RpGATA23與RpSK6啟動子的相互作用。
熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果進一步證實了酵母單雜交實驗的發(fā)現(xiàn)，即RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6的啟動子結(jié)合并激活其表達（圖5B）。這表明這些轉(zhuǎn)錄因子在不定根再生過程中通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達發(fā)揮重要作用。
（8）亞細(xì)胞定位分析揭示以RpMYB2為中心的互作網(wǎng)絡(luò)中蛋白的亞細(xì)胞定位
亞細(xì)胞定位分析顯示，RpMYB2及其互作蛋白主要定位于細(xì)胞核，部分蛋白如RpSDP和RpWRKY23還定位于細(xì)胞質(zhì)膜（圖6）。這表明這些蛋白在細(xì)胞核內(nèi)與其他基因相互作用，調(diào)控基因表達，同時也可能參與細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的生物學(xué)過程。
圖6：RpMYB2互作蛋白的亞細(xì)胞定位。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示了用GFP標(biāo)記的蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。所有研究的蛋白主要定位于細(xì)胞核。RpMYB2、RpSDP和RpWRKY23還顯示出在質(zhì)膜定位。
結(jié)論和啟示
本研究通過WGBS和RNA-seq技術(shù)揭示了DNA低甲基化在刺槐不定根再生中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-azaC處理通過降低基因組整體甲基化水平，激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，顯著增強了不定根的再生能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物再生的分子機制提供了新的視角，還為通過遺傳改良提高植物再生能力和適應(yīng)環(huán)境脅迫提供了潛在的靶點。
WGBS和RNA-seq技術(shù)在解析植物表觀遺傳調(diào)控中的重要作用
WGBS和RNA-Seq的聯(lián)合應(yīng)用，研究者能夠從表觀遺傳修飾和基因表達兩個層面，全面解析DNA低甲基化在不定根再生中的調(diào)控機制。通過整合分析，研究者發(fā)現(xiàn)低甲基化位點和區(qū)域的變化直接導(dǎo)致了相關(guān)基因表達的激活，從而促進了不定根的再生。這種協(xié)同分析不僅揭示了DNA甲基化對基因表達的調(diào)控作用，還為理解植物再生過程中的表觀遺傳調(diào)控機制提供了新的視角。
關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
易基因全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。
應(yīng)用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點）
- 全基因組甲基化圖譜課題
- 標(biāo)志物篩選課題
- 小規(guī)模研究課題
- 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
- 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
- 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
Hussain SS, Li Y, Liu J, Abbas M, Li Q, Deng H, Abbas S, Han K, Han J, Sun Y, Li Y. DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots. Plant Cell Environ. 2024 Oct 28. doi: 10.1111/pce.15236.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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