整合質(zhì)譜儀助力高效優(yōu)化畢赤酵母發(fā)酵工藝

甲醇在畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中的雙面角色
畢赤酵母在疫苗、酶制劑及醫(yī)藥蛋白生產(chǎn)中的高效表達(dá)能力與后修飾優(yōu)勢(shì)，使其成為工業(yè)微生物工程研究的重點(diǎn)對(duì)象。

然而，甲醇在其發(fā)酵過(guò)程中兼具碳源與誘導(dǎo)劑雙重角色，補(bǔ)料量控制直接影響蛋白表達(dá)效率和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。過(guò)量甲醇會(huì)造成毒性累積，抑制生長(zhǎng)；而不足則會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)不充分。

傳統(tǒng)發(fā)酵監(jiān)控方式中，甲醇補(bǔ)料往往依據(jù)溶氧（DO）變化趨勢(shì)判斷，或設(shè)定定時(shí)定量補(bǔ)料方案。此類方式存在較大滯后性與人工依賴性，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲醇動(dòng)態(tài)濃度的精細(xì)控制。

在線監(jiān)測(cè)甲醇濃度，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化反饋控制
迪必爾研發(fā)人員在工藝平臺(tái)引入在線氣體質(zhì)譜分析系統(tǒng)，結(jié)合四聯(lián)平行反應(yīng)器系統(tǒng)與UDF（用戶自定義功能）算法控制邏輯，構(gòu)建了一套高通量、在線監(jiān)測(cè)、高頻反饋、自動(dòng)補(bǔ)料的智能工藝平臺(tái)。實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵尾氣中甲醇濃度的智能檢測(cè)和精確反饋控制（圖1）。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該系統(tǒng)在發(fā)酵調(diào)控精度、蛋白表達(dá)效率及人力、時(shí)間成本控制方面具有較大優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備及軟件系統(tǒng)：
發(fā)酵罐：CloudReady 4聯(lián)（迪必爾生物）
質(zhì)譜儀：DECRA （Hiden Analytical）
多通道尾氣切換裝置：Xgas（迪必爾生物）
多通道尾氣分析儀：Xgas（迪必爾生物）
軟件系統(tǒng)：D2MS設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（迪必爾生物）
控制算法程序載體：UDF用戶自定義控制（D2MS內(nèi)置）

圖1 智能尾氣分析及反饋控制系統(tǒng)

系統(tǒng)集成途徑：
基于D2MS接入多種設(shè)備，在HMI界面實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。可實(shí)時(shí)查看發(fā)酵參數(shù)與尾氣參數(shù)，支持多通道尾氣切換裝置時(shí)間設(shè)定、發(fā)酵罐自由組合及當(dāng)前采樣通道狀態(tài)指示等功能，為多通道數(shù)據(jù)采集與控制操作提供一體化管理支持（圖2）。

圖2 整合多設(shè)備參數(shù)控制的D2MS HMI界面

通過(guò)D2MS內(nèi)置UDF模塊開(kāi)發(fā)濃度梯度模型，可實(shí)現(xiàn)甲醇濃度（0-40 ppm）與補(bǔ)料速率（1.5-15 mL/h）之間的智能關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)（圖3）。

圖3 D2MS UDF反饋控制算法控制邏輯

實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果分析

1、冷模實(shí)驗(yàn)建模：
建立液-氣關(guān)系模型，為液相甲醇濃度與尾氣甲醇質(zhì)譜的響應(yīng)提供依據(jù)（圖4）。

圖4 甲醇液-氣冷模測(cè)試結(jié)果模型

2、質(zhì)譜儀檢測(cè)對(duì)比經(jīng)驗(yàn)判斷實(shí)驗(yàn)
如圖5，單通道檢測(cè)模式下，在92h之前，實(shí)驗(yàn)組（儀器檢測(cè)）和對(duì)照組（經(jīng)驗(yàn)判斷）生物量均增長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)組較低。到116h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組反超對(duì)照組，最終在166h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OD₆₀₀nm值提高60.1%，濕重提高41.8%，表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

結(jié)果表明儀器檢測(cè)相較經(jīng)驗(yàn)判斷，能顯著提升發(fā)酵液的生物量。

圖5 單通道模式上罐結(jié)果對(duì)比

3、質(zhì)譜儀多通道檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（儀器檢測(cè)手動(dòng)調(diào)控）：
圖6為通過(guò)人工調(diào)整補(bǔ)料速率實(shí)現(xiàn)過(guò)程控制。四個(gè)發(fā)酵罐最終總蛋白產(chǎn)量分別為 9360.82、8479.99、8607.31 和9167.33 mg，差異較小。四組平均產(chǎn)量為 8903.86 mg（RSD=4.79%），均高于單通道模式下的8000.26 mg（圖5），最高增幅達(dá)16.99%。

結(jié)果表明，該策略在提升蛋白表達(dá)效率和系統(tǒng)可靠性的同時(shí)，也驗(yàn)證了多通道轉(zhuǎn)換器在發(fā)酵過(guò)程中的實(shí)用性與有效性，但手動(dòng)調(diào)控在高通量發(fā)酵的平行性上還有提升空間。

圖6 MFC限流下多通道尾氣分析上罐結(jié)果

4、質(zhì)譜儀多通道檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（智能調(diào)控自動(dòng)補(bǔ)料）：
如圖7，智能控制下四罐總蛋白產(chǎn)量在188 h分別達(dá)16843.80、17479.99、17952.49、17054.86 mg，四組平均產(chǎn)量為17332.79 mg（RSD=2.83%），較手動(dòng)調(diào)控模式（均值約8903 mg）提升約94.7%，較單通道對(duì)照組（7955.41 mg）提升約117.9%。

結(jié)果表明，智能調(diào)控模式相比手動(dòng)調(diào)控能更能有效提升蛋白表達(dá)量，并且在長(zhǎng)周期運(yùn)行中能保持穩(wěn)定性與精確性。同時(shí)高通量發(fā)酵中的平行性更好（蛋白產(chǎn)量 RSD 由4.79%進(jìn)一步降至 2.83%，較手動(dòng)模式RSD降低 40.8%），具備良好的可重復(fù)性。

圖7 三通道分流下多通道尾氣分析上罐結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這套智能尾氣分析及反饋控制系統(tǒng)具備優(yōu)異的響應(yīng)速度、控制精度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，對(duì)于提升工藝開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)效率、提升產(chǎn)量有顯著作用。

數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)工藝智能化
該系統(tǒng)在提升工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域的研發(fā)、中試和生產(chǎn)效率方面具有廣泛的應(yīng)用前景。未來(lái)，可進(jìn)一步集成多因子反饋機(jī)制，并拓展至其他底物誘導(dǎo)體系，推動(dòng)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的智能化生物制造平臺(tái)的迭代升級(jí)。

應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心 管志欣供稿

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