3D生物反應器與微流控芯片的微凝膠培養(yǎng)介紹及相關問題解答
本文開發(fā)了一種微流控體外細胞封裝平臺，用于研究 3D 微環(huán)境參數(shù)對細胞命運的影響。該平臺基于酶交聯(lián)的聚乙二醇（PEG）基微凝膠，其機械特性（彈性 300-3000 Pa）、生化特性（如整合素結(jié)合肽 RGD）和降解性（含 MMP 底物或非降解肽）可精確調(diào)控，成功封裝了成纖維細胞、胚胎干細胞（ESCs）、癌細胞等多種細胞。通過優(yōu)化（如添加 OptiPrep 調(diào)節(jié)密度、延長胰蛋白酶處理時間），細胞封裝效率從 20% 提升至60%；為解決細胞逃逸問題，采用雙重封裝策略（微凝膠包埋于非降解凝膠中），實現(xiàn)了長達15 天的長期培養(yǎng)，可觀察細胞活力、增殖和形態(tài)變化。該平臺為研究細胞與微環(huán)境的相互作用提供了精準工具。
1. 引言
- 背景：3D 細胞培養(yǎng)比 2D 更接近原生微環(huán)境，但現(xiàn)有技術難以整合微環(huán)境多參數(shù)（如 ECM 剛度、可溶性信號）的獨立調(diào)控。
- 研究目標：構(gòu)建基于微凝膠的 3D 細胞培養(yǎng)平臺，實現(xiàn)微環(huán)境參數(shù)的精準調(diào)控，研究細胞對復雜微環(huán)境的響應。
CERO 3D細胞(類器官)生物反應器
2. 結(jié)果與討論
2.1 微流控細胞封裝
- 材料設計：采用 8 臂 PEG - 乙烯砜（VS），通過凝血因子 XIIIa（FXIIIa）酶促交聯(lián)；含 MMP 底物肽（GPQGIWGQ）的微凝膠可降解，含 GDQGIAGF 的為非降解型；RGD 肽促進細胞粘附。
- 微流控裝置：四入口流動聚焦設計，中間通道通入 PEG + 細胞混合液，側(cè)通道通入 FXIIIa + 鈣緩沖液及含表面活性劑的礦物油，形成單分散微凝膠（直徑 80-150 μm）。
- 封裝特性：細胞分布符合泊松分布，通過調(diào)節(jié)初始濃度控制每滴細胞數(shù)（0-2 個）；封裝后細胞活力達 90%（PI 染色）。
2.2 封裝效率優(yōu)化
問題：細胞與培養(yǎng)基密度差異（1.1 vs 1.0 g/mL）導致沉降，1 小時后封裝效率僅 20%。
優(yōu)化措施：
l 添加 OptiPrep 調(diào)節(jié)密度：16% OptiPrep（100 μL 培養(yǎng)基中加 16 μL）在 0、30 分鐘時細胞數(shù)最多，適配成纖維細胞；癌細胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。
l 延長胰蛋白酶處理：8 分鐘處理減少細胞聚集，結(jié)合 OptiPrep 使效率提升至 60%。
問題：細胞與培養(yǎng)基密度差異（1.1 vs 1.0 g/mL）導致沉降，1 小時后封裝效率僅 20%。
優(yōu)化措施：
l 添加 OptiPrep 調(diào)節(jié)密度：16% OptiPrep（100 μL 培養(yǎng)基中加 16 μL）在 0、30 分鐘時細胞數(shù)最多，適配成纖維細胞；癌細胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。
l 延長胰蛋白酶處理：8 分鐘處理減少細胞聚集，結(jié)合 OptiPrep 使效率提升至 60%。
| OptiPrep 濃度（μL/100μL 培養(yǎng)基） | 0 分鐘細胞數(shù) | 30 分鐘細胞數(shù) | 60 分鐘細胞數(shù) |
| 0 | 低 | 顯著下降 | 極低 |
| 8 | 中 | 下降明顯 | 低 |
| 16 | 高 | 較高 | 中 |
| 24 | 中 | 中 | 較高 |
| 32 | 低 | 下降 | 低 |
2.3 防止細胞逃逸
- 現(xiàn)象：ESCs 在 20 小時后開始逃逸，癌細胞也存在類似問題，與微凝膠特性和細胞類型相關。
- 解決方案：
- 方法 1：將微凝膠包埋于 200 μm 厚的非降解 PEG 凝膠（通過 Michael 加成交聯(lián)），阻止細胞遷移；但不利于細胞回收。
- 方法 2：微流控雙重封裝（微凝膠再包埋于非降解 PEG 微珠中），結(jié)合 16% OptiPrep 使共封裝效率達 40%，實現(xiàn)無細胞逃逸。
2.4 長期培養(yǎng)結(jié)果
- 細胞活力：在 5% PEG（40 kPa）外層凝膠中，500 Pa 和 1000 Pa 微凝膠內(nèi)細胞 15 天存活率較高；10% PEG（100 kPa）外層凝膠因腫脹壓迫，細胞活力顯著下降。
- 細胞增殖：ESCs 在 500 Pa 微凝膠中 4 天內(nèi)體積增加 3 倍，1000 Pa 微凝膠中增加 2.5 倍且 4 天時有更多細胞死亡。
3. 結(jié)論
該平臺實現(xiàn)了微環(huán)境多參數(shù)的獨立調(diào)控，通過優(yōu)化封裝效率和解決細胞逃逸，可用于長期研究細胞行為。未來可設計可選擇性降解的外層凝膠，以兼顧細胞限制與回收需求。
4. 實驗要點
- 材料：PEG 衍生物（8 臂 PEG-VS、4 臂 PEG-SH）、FXIIIa 酶、RGD 肽、OptiPrep 等。
- 微流控芯片：PDMS 材質(zhì)，通道深度 100-150 μm，流動聚焦設計。
- 表征：流變學測彈性模量，共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)，活死染色評估活力。
關鍵問題
該微流控細胞封裝平臺的核心優(yōu)勢是什么？
核心優(yōu)勢在于微環(huán)境參數(shù)的精準且獨立調(diào)控，包括：機械特性（通過 PEG 濃度調(diào)節(jié)彈性 300-3000 Pa）、生化信號（如 RGD 肽介導細胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同時結(jié)合微流控技術實現(xiàn)單分散微凝膠的高效制備，封裝效率可達 60%，并能通過雙重封裝實現(xiàn) 15 天長期培養(yǎng)。
研究中如何解決細胞從微凝膠中逃逸的問題？效果如何？
采用雙重封裝策略：將細胞負載微凝膠進一步包埋于非降解 PEG 凝膠中（薄膜或微珠形式）。非降解凝膠通過小孔徑和高剛度阻止細胞遷移（包括阿米巴運動和間質(zhì)運動）。結(jié)果顯示，該方法可完全阻止細胞逃逸，使細胞在 15 天培養(yǎng)中保持在微凝膠內(nèi)，且能穩(wěn)定監(jiān)測活力、增殖和形態(tài)。
該研究對細胞生物學或再生醫(yī)學有何潛在應用？
潛在應用包括：系統(tǒng)研究微環(huán)境參數(shù)（如剛度、生化信號）對細胞命運（如干細胞分化、癌細胞侵襲）的影響；開發(fā)高通量藥物篩選模型（基于可控微環(huán)境）；優(yōu)化細胞移植策略（通過微凝膠保護細胞免受免疫攻擊并調(diào)控其功能）。此外，平臺的參數(shù)可調(diào)性為 mechanotransduction（機械傳導）機制研究提供了工具。
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核心優(yōu)勢在于微環(huán)境參數(shù)的精準且獨立調(diào)控，包括：機械特性（通過 PEG 濃度調(diào)節(jié)彈性 300-3000 Pa）、生化信號（如 RGD 肽介導細胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同時結(jié)合微流控技術實現(xiàn)單分散微凝膠的高效制備，封裝效率可達 60%，并能通過雙重封裝實現(xiàn) 15 天長期培養(yǎng)。
研究中如何解決細胞從微凝膠中逃逸的問題？效果如何？
采用雙重封裝策略：將細胞負載微凝膠進一步包埋于非降解 PEG 凝膠中（薄膜或微珠形式）。非降解凝膠通過小孔徑和高剛度阻止細胞遷移（包括阿米巴運動和間質(zhì)運動）。結(jié)果顯示，該方法可完全阻止細胞逃逸，使細胞在 15 天培養(yǎng)中保持在微凝膠內(nèi)，且能穩(wěn)定監(jiān)測活力、增殖和形態(tài)。
該研究對細胞生物學或再生醫(yī)學有何潛在應用？
潛在應用包括：系統(tǒng)研究微環(huán)境參數(shù)（如剛度、生化信號）對細胞命運（如干細胞分化、癌細胞侵襲）的影響；開發(fā)高通量藥物篩選模型（基于可控微環(huán)境）；優(yōu)化細胞移植策略（通過微凝膠保護細胞免受免疫攻擊并調(diào)控其功能）。此外，平臺的參數(shù)可調(diào)性為 mechanotransduction（機械傳導）機制研究提供了工具。
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