使用滴定儀和FRAP成象儀研究濕度對(duì)蛋白液滴蒸發(fā)的影響

介紹

蒸汽擴(kuò)散現(xiàn)仍是用于生長(zhǎng)蛋白質(zhì)晶體以進(jìn)行X射線(xiàn)衍射的最常用技術(shù)。在這種方法中，將蛋白質(zhì)溶液與儲(chǔ)液混合，將這種混合物的小體積液滴與體積較大的儲(chǔ)液平衡。液滴溶液具有較低的溶質(zhì)濃度，與儲(chǔ)液溶液相比具有較高的蒸汽壓，這導(dǎo)致水隨著時(shí)間的推移從液滴擴(kuò)散到儲(chǔ)液溶液，直到兩者達(dá)到平衡。液滴的水分蒸發(fā)導(dǎo)致蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度的增加，使蛋白質(zhì)通過(guò)亞穩(wěn)相進(jìn)入晶體成核相。

平衡速率取決于幾個(gè)因素：所使用的沉淀劑的類(lèi)型和濃度、溫度、濕度、液滴和儲(chǔ)液器之間的距離、以及液滴：儲(chǔ)層體積比2。在結(jié)晶板的設(shè)置過(guò)程中，液滴的蒸發(fā)會(huì)導(dǎo)致液滴與儲(chǔ)層體積比的不良變化。對(duì)于給定的儲(chǔ)層體積，較小的液滴平衡更快，在有利于晶體形成的條件下，可能會(huì)引發(fā)過(guò)度成核，從而導(dǎo)致更小的晶體尺寸。由于局部蛋白質(zhì)或沉淀劑濃度高，大量的水蒸發(fā)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，形成鹽晶體（例如硫酸銨晶體），液滴表面形成皮膚，或液滴干燥。

直接影響水滴蒸發(fā)速率的因素是相對(duì)濕度（RH）。高RH在設(shè)置結(jié)晶板，可以減緩蒸發(fā)過(guò)程。結(jié)晶板放置的房間里的RH通常沒(méi)有嚴(yán)格的規(guī)定，而且會(huì)隨著季節(jié)的變化而變化。這可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶試驗(yàn)結(jié)果的差異，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性產(chǎn)生負(fù)面影響，這是目前科學(xué)界面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。

在蛋白質(zhì)晶體學(xué)中使用機(jī)器人來(lái)處理液體，提高了液滴分配的準(zhǔn)確性，并加快了結(jié)晶板的制備速度，以避免大量的水滴蒸發(fā)。然而，即使提高了液滴分配的速度和準(zhǔn)確性，平均仍需要2-10分鐘才能完成每液滴1-3 滴的96-孔板的制備。一些結(jié)晶機(jī)器人，包括富默樂(lè)的NT8移液工作站，可以在制版過(guò)程中精確控制濕度，顯著減少液滴蒸發(fā)。濕度通過(guò)限制需要優(yōu)化的變量控制，提高了可重復(fù)性，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再依賴(lài)于結(jié)晶板上的分液位置、時(shí)間準(zhǔn)備，或者制備時(shí)所處的季節(jié)，而主要受成分濃度和體積的影響。

在本應(yīng)用手冊(cè)中，我們?cè)u(píng)估了濕度對(duì)結(jié)晶板制備過(guò)程中液滴大小和組成的影響。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置

為了測(cè)試不同沉淀劑對(duì)液滴蒸發(fā)速率的影響，我們選擇了三種溶液:

1. 0.5 mM熒光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5

2. 0.5 mM熒光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 20% PEG 10K

3. 0.5 mM熒光素，10% DMSO, 100 mM Hepes pH 7.5, 1.6 M硫酸銨

它們?cè)谶@里分別稱(chēng)為緩沖液、聚乙二醇和硫酸銨。

使用富默樂(lè)的NT8滴定儀在結(jié)晶板上分液。在LCP夾層板(Hampton HR3-1510)上分配200 nL和1μL體積的液滴。目的是研究在10分鐘內(nèi)液滴蒸發(fā)的情況，這是滴落器準(zhǔn)備96-孔板（每孔3滴）所需的平均時(shí)間。為了達(dá)到這個(gè)時(shí)間范圍，在每列分液之后，機(jī)器人需要等待40秒鐘才能繼續(xù)分配。之所以選擇LCP板，是因?yàn)閵A層的組裝可以防止快速滴蒸發(fā)，從而在液滴體積明顯損失之前有時(shí)間對(duì)板進(jìn)行成像。此外，液滴被壓下，液滴的厚度是均勻的。因此，液滴面積可以用來(lái)估計(jì)從不同的孔板和有不同的成分液滴之間的體積變化。否 則，就必須考慮液滴的形狀，包括水滴的不同厚度。

用來(lái)自富默樂(lè)的FRAP成象儀在熒光素激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485nm和524 nm的熒光模式下對(duì)孔板進(jìn)行成 像。不同孔板的曝光時(shí)間不同。根據(jù)孔容量的不同，液滴成像時(shí)間為400-2000 ms，以獲得液滴與孔底之間的高對(duì)比度。將增值設(shè)置為1。每個(gè)液滴在15個(gè)聚焦層上成像，并將所有圖像合并為一個(gè)擴(kuò)展聚焦圖像，用于計(jì)算液滴的表面積。來(lái)自熒光素的強(qiáng)烈熒光信號(hào)可以方便和精確地定位液滴位置。

使用ImageJ軟件測(cè)量液滴大小。對(duì)于每一滴水（每孔板96滴），液滴圖像被轉(zhuǎn)換為8位灰度。想測(cè)量的對(duì)象的強(qiáng)度閾值設(shè)置為40-255范圍。計(jì)算大于1000px的顆粒的粒徑，每個(gè)孔僅需進(jìn)行一次測(cè)量即可反映出液滴的大小。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，設(shè)置8個(gè)獨(dú)立的液滴，測(cè)量每個(gè)液滴的表面積，并基于這些測(cè)量結(jié)果計(jì)算平均液滴大小。實(shí)驗(yàn)誤差計(jì)算為獲得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。液滴大小與液滴平均大小相差50%以上的液滴被排除在最終計(jì)算之外（1728次測(cè)量中有25次）。液滴的體積損失表示為平均液滴面積除以最后分配在孔板上的液滴面積（參考液滴）的百分比。

結(jié)論

1. 在有和沒(méi)有濕度控制的情況下設(shè)置的液滴蒸發(fā)速率。

在設(shè)置為環(huán)境RH或85％RH（由NT8濕度控制室確保）的控制上，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)結(jié)晶液滴的大小。在環(huán)境相對(duì)濕度下，開(kāi)始制備孔板后的1.8分鐘內(nèi)，對(duì)于所有測(cè)試條件，200 nL的25％的滴液和1μL的15％滴液已蒸發(fā)（圖1）。2.7分鐘后，大概是分配一個(gè)每孔1滴的96-孔板所需的時(shí)間，對(duì)于200 nL液滴，蒸發(fā)了29％ 的PEG，32％的硫酸銨和39％的緩沖液條件（表1）。

1μL時(shí)的液滴損失略低，在18％至25％之間變化。6.3分鐘后，在200 nL /1μL液滴中，PEG的液滴損失增加至42/41％，硫酸銨的液滴損失增加至52/43％，緩沖液的液滴損失增加至55/48％。

將相對(duì)濕度從環(huán)境RH（50％）增加到85％RH會(huì)顯著降低液滴的蒸發(fā)速率（圖1）。在85％的相對(duì)濕度下 2.7分鐘后，在任何條件下（0-3％，這均在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)），液滴尺寸均無(wú)明顯下降。6.3分鐘后，對(duì)于200 nL液滴，液滴大小減小0-10％，對(duì)于1μL液滴，液滴大小減小2-7％，與環(huán)境RH中的液滴損失相比，下降了約5倍。在此實(shí)驗(yàn)裝置中，溶液類(lèi)型與蒸發(fā)速率之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。

圖1. 對(duì)于3種不同的溶液，在2個(gè)RH設(shè)置（環(huán)境RH為50%和RH設(shè)置為85%）中，在10分鐘過(guò)程中剩余的200 nL(上)和1μL(下)滴度的百分比。誤差條表示實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次后液滴面積的標(biāo)準(zhǔn)差。

表1. 在2.7分鐘和6.3分鐘時(shí)，液滴蒸發(fā)與參考液滴相比的百分比。

2. RH為95％的液滴大小

我們還評(píng)估了在95％的濕度下隨時(shí)間流逝的液滴損失。在這種濕度設(shè)置下，孔板上會(huì)覆蓋薄霧，這可能會(huì)造成液滴吸收水分而導(dǎo)致液滴尺寸增加。但是，在95％的濕度下，1μL液滴的液滴大小沒(méi)有明顯增加。相反，在200 nL液滴中，有40％的液滴大小與參考液滴相比增加了5％以上。對(duì)于在95％RH條件下 在板上停留超過(guò)9.0分鐘的液滴，觀(guān)察到PEG和緩沖液200 nL液滴的大小增加，而對(duì)于硫酸銨，是在3.6分鐘后觀(guān)察到液滴大小增加。

3. 在夾層組裝之前，為PEG和硫酸銨干燥的液滴百分比

在室溫下的某些條件下，在制備孔板的過(guò)程中，選定的液滴會(huì)變干。在200 nL PEG條件下，一些液滴在 2.7分鐘后變干（表1）。6分鐘后，最初的1μL液滴變干 4.5分鐘后，硫酸銨滴200 nL和1μL開(kāi)始干燥。緩沖液滴的大小有所減小，但在10分鐘的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未完全變干。總之，在孔板制備的10分鐘后，平均38％的PEG液滴和58％的硫酸銨液滴被完全干燥（圖2）。此外，在制板5分鐘后，硫酸銨晶體開(kāi)始在200 nL 液滴中出現(xiàn)（圖3）。相反，在將RH設(shè)置為85％的受控RH環(huán)境中設(shè)置的任何條件下，滴液都不會(huì)變干，也不會(huì)形成鹽晶。

圖2. A)環(huán)境RH為50%，B)孔板制備10分鐘后，相對(duì)濕度為85%。從左到右依次為200nl，1μL硫酸銨條件，200nl, 1μL PEG條件。

圖 3. 結(jié)晶板制備 5分鐘后硫酸銨晶體的形成。

結(jié)論

本文中，我們研究了RH對(duì)制版過(guò)程中結(jié)晶液滴蒸發(fā)的影響。在2.7分鐘后，在環(huán)境RH中設(shè)置的200 nL和1μL 液滴平均損失了32％和22％的體積，而在85％RH條件下，沒(méi)有觀(guān)察到液滴體積的損失。值得注意的是，市售移液器制備96-孔板每孔1滴所需的平均時(shí)間為2-3 分鐘。當(dāng)在室溫RH條件下蒸發(fā)49％的200 nL液滴和44％的1μL液滴后，這種液滴大小差異在6.3分鐘后變得更加明顯。然而在85% RH下，200 nl的液滴只有7%蒸發(fā)，1μL的液滴只有5.3%蒸發(fā)。液滴損失的這種顯著減少大大影響了液滴中溶質(zhì)的濃度，這影響了液滴蒸發(fā)的速度，在極端情況下可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。在這種情況下，無(wú)法獲得結(jié)晶并不是原始條件不適合結(jié)晶形成的結(jié)果，也不能準(zhǔn)確地代表篩選出的結(jié)晶空間來(lái)選擇好的結(jié)晶條件。但是，可以通過(guò)使用高于環(huán)境濕度的RH來(lái)避免此問(wèn)題，正如我們已展示的那樣，RH可以減少液滴的蒸發(fā)。濕度控制室是富默樂(lè) NT8移液器的一部分，使用戶(hù)可以在制版過(guò)程中精確控制濕度水平。