使用TR-FRET結(jié)合分析研究分子內(nèi)雙價(jià)分子膠

靶向蛋白質(zhì)降解（TPD）是通過(guò)誘導(dǎo)E3泛素連接酶和靶向蛋白質(zhì)的接近來(lái)完成的，以促進(jìn)靶向泛素化和隨后的蛋白酶體降解。TPD是一種新興的治療工具，在處理致病蛋白方面具有巨大潛力。過(guò)去，TPD是通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)的：一是使用蛋白質(zhì)降解-靶向嵌合體（PROTACs），即由兩個(gè)獨(dú)立部分組成的雙功能化合物，分別與靶點(diǎn)和E3連接酶結(jié)合；二是使用單價(jià)結(jié)合連接酶或靶點(diǎn)的分子膠。

在今天的文章中，我們重點(diǎn)介紹一種名為分子內(nèi)雙價(jià)粘合劑（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的新型BRD4雙功能降解劑的作用機(jī)制，它為靶向蛋白質(zhì)降解引入了新的模式。不同于PROTACs以trans構(gòu)象連接目標(biāo)蛋白和E3連接酶，IBGs以cis構(gòu)象同時(shí)作用并連接目標(biāo)蛋白的兩個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)域，從而增強(qiáng)與E3連接酶的表面互補(bǔ)性。這種構(gòu)象變化利用目標(biāo)蛋白與連接酶的天然親和力，將BRD4“粘”在E3連接酶DCAF16上，從而降解BRD4，而如果沒(méi)有這種化合物，則不會(huì)發(fā)生這種降解。通過(guò)對(duì)BRD4–IBG1–DCAF16三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析，進(jìn)一步指導(dǎo)了更高效降解劑的理性設(shè)計(jì)，使其效力達(dá)到低皮摩爾級(jí)別。

使用TR-FRET分析三元復(fù)合物形成

通過(guò)時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）形成分析法評(píng)估BRD4和DCAF16的三元復(fù)合物形成。該分析法使用針對(duì)BRD4的銪標(biāo)記抗體和Cy5標(biāo)記的DCAF16。如果IBG分子誘導(dǎo)標(biāo)記的BRD4和DCAF16分子之間形成三元復(fù)合物，則熒光團(tuán)之間的距離足夠近，可以形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）對(duì)。因此，激發(fā)銪供體熒光團(tuán)將導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移，而Cy5受體熒光可以用酶標(biāo)儀測(cè)量。

圖2：A）TR-FRET三元復(fù)合物形成分析：Eu標(biāo)記抗His抗體與BRD4Tandem結(jié)合后，加入等摩爾Cy5-DCAF16及不同濃度的IBG1或JQ1。結(jié)果以n=3次重復(fù)的平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。B）TR-FRET復(fù)合物穩(wěn)定性分析：His標(biāo)記的BRD4Tandem或BRD4BD1（200 nM）與Eu抗His抗體結(jié)合后，加入不同濃度的Cy5-DCAF16，并比較1 μM IBG1存在與否的效果。n=2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，技術(shù)重復(fù)2次。

進(jìn)一步優(yōu)化的IBG化合物

在確認(rèn)IBG1的作用機(jī)制后，研究人員合成了新的化合物，以增強(qiáng)其對(duì)BRD4和DCAF16的分子膠合活性。新化合物IBG3在降解BRD4方面優(yōu)于IBG1，其降解效率達(dá)到低皮摩爾水平（DC50 = 6.7 pM，數(shù)據(jù)未公開）。TR-FRET實(shí)驗(yàn)中，IBG3對(duì)BRD4–DCAF16復(fù)合體的“粘合”能力也有所提升（EC50 = 32 nM；見(jiàn)圖3）。

圖3：TR-FRET三元復(fù)合物形成測(cè)定。將抗組蛋白結(jié)合到BRD4Tandem的抗組蛋白與等摩爾Cy5標(biāo)記的DCAF16以及濃度不斷增加的IBG1、IBG3或JQ1混合。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。

與其前體化合物類似，IBG3相較于BRD3顯示出對(duì)BRD2和BRD4更高的特異性，更傾向于作用于串聯(lián)溴結(jié)構(gòu)域而非孤立結(jié)構(gòu)域，并且其機(jī)制仍由DCAF16介導(dǎo)，表明其仍通過(guò)同樣的分子內(nèi)“膠合作用”實(shí)現(xiàn)降解。

結(jié)論

通過(guò)本文所描述的TR-FRET相互作用分析方法，可表征BRD4-DCAF16之間的新型分子膠。該類新型分子內(nèi)雙價(jià)膠通過(guò)同時(shí)結(jié)合目標(biāo)蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)其與E3連接酶的親和力，形成新的相互作用模式。這一策略為靶向多種效應(yīng)蛋白、重構(gòu)細(xì)胞信號(hào)通路、實(shí)現(xiàn)蛋白降解及其他用途提供了前景廣闊的藥理學(xué)路徑。

圖4：PHERAstar FSX酶標(biāo)儀。
 

轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH
 

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