單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示驅(qū)動肉芽腫形成的異常淋巴發(fā)育程序

關(guān)鍵技術(shù)
scRNA-seq、ST-seq、Total seq

實驗結(jié)果
1. 巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是皮膚肉芽腫的主要細(xì)胞類型
為研究肉芽腫的細(xì)胞組成和基因調(diào)控，對12名皮膚結(jié)節(jié)病患者的病變和非病變皮膚活檢樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）（Fig1A）。得到56000個細(xì)胞，通過注釋得到淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等八種主要的細(xì)胞類型（Fig 1B），并發(fā)現(xiàn)病變皮膚與非病變皮膚相比存在廣泛的轉(zhuǎn)錄變化（Fig 1C）。為繪制肉芽腫的組織背景，對所有12名患者的皮膚活檢樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和免疫熒光蛋白染色（Fig1A）。利用從scRNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的基因特征，將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征分解為病變和非病變皮膚區(qū)域（Fig1D）。免疫熒光識別出CD3+ T細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞和CD90+成纖維細(xì)胞是肉芽腫內(nèi)的主要細(xì)胞類型（Fig1E），這證實并擴展了的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析。
 

Fig 1

2. 特異性巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞亞群在肉芽腫中聚集
根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性識別出20個細(xì)胞簇，并根據(jù)marker基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)記，在病變和非病變皮膚中觀察到7個非免疫細(xì)胞群和13個免疫細(xì)胞群（Fig 2A-B）。其中病變巨噬細(xì)胞、病變輔助T細(xì)胞和病變成纖維細(xì)胞幾乎僅在病變皮膚中發(fā)現(xiàn)其（Fig 2C）。為評估細(xì)胞亞群的定位，對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，得到四個群（Fig 2D）。并從組織學(xué)角度將這些群注釋為肉芽腫性真皮、未受影響的真皮和表皮；結(jié)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析顯示，病變亞群的巨噬細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞主要存在于肉芽腫性真皮群中，而非病變亞群則存在于未受影響的真皮群中（Fig2E-F）。將病變和非病變巨噬細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)譜映射到所有樣本的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)譜上，進(jìn)一步證實了這一觀察結(jié)果，病變基因集在肉芽腫內(nèi)部表現(xiàn)出高活性，而非病變基因集主要在周圍的真皮中表達(dá)（Fig2G）。
 

Fig 2

3. GA巨噬細(xì)胞顯示出強烈的促炎信號
為研究皮膚肉芽腫中巨噬細(xì)胞的作用，對所有巨噬細(xì)胞進(jìn)行了降維和無監(jiān)督聚類分析，得出了兩個主要亞群。cluster 0中的細(xì)胞與病變皮膚相關(guān)，而cluster 1群中的細(xì)胞主要來源于非病變皮膚；差異分析揭示cluster 0中髓系細(xì)胞的慢性激活轉(zhuǎn)錄譜，將cluster 0群相關(guān)的髓系細(xì)胞稱為“肉芽腫相關(guān)（GA）巨噬細(xì)胞”，并將1群中的細(xì)胞稱為“穩(wěn)態(tài)巨噬細(xì)胞”（Fig 3A-B）。GA巨噬細(xì)胞高表達(dá)ACE、CHI3L1、CHIT1、CYP27A1、S100A8、IFNGR1及多種與IFN-γ激活、溶酶體功能、細(xì)胞外基質(zhì)和代謝相關(guān)的基因，表現(xiàn)出一種非典型、促炎且代謝活躍的巨噬細(xì)胞表型（Fig3B）。為進(jìn)一步表征GA巨噬細(xì)胞，重新聚類了所有巨噬細(xì)胞，并識別出兩個病變亞群：GA巨噬細(xì)胞群GA0和GA1（Fig3C）。GA0巨噬細(xì)胞高表達(dá)與結(jié)節(jié)病相關(guān)的基因以及金屬蛋白酶，而這些基因在GA1巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；同時，GA0巨噬細(xì)胞的基因特征被特異性定位到結(jié)節(jié)病肉芽腫區(qū)域，提示GA0巨噬細(xì)胞在肉芽腫形成和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Fig3D-F）。GA0巨噬細(xì)胞高表達(dá)編碼巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的CSF1基因，這是巨噬細(xì)胞生存、分化和增殖的關(guān)鍵因子，可以分泌M-CSF，從而增加局部組織炎癥，并與CHIT1、CCL20、IL23A、MMP12和DCSTAMP等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)升高密切相關(guān)，提示GA0巨噬細(xì)胞具備促進(jìn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移和多核巨細(xì)胞形成的能力（Fig3G）。
 

Fig 3

4. 具有Th17.1表型的T細(xì)胞在肉芽腫中富集
將淋巴細(xì)胞細(xì)分，識別出包括輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞等七種淋巴細(xì)胞；cluster 0的輔助性T細(xì)胞包括病變和非病變皮膚細(xì)胞，而cluster 1的細(xì)胞主要來自病變皮膚（Fig4A）。將cluster 0稱為穩(wěn)態(tài)輔助性T細(xì)胞，將cluster 1稱為GA輔助性T細(xì)胞，構(gòu)成了一個肉芽腫特異性的細(xì)胞亞群。GA輔助性T細(xì)胞表現(xiàn)出慢性激活的Th17.1表型，由IL-23和IL-12驅(qū)動，產(chǎn)生大量IFN-γ和GM-CSF激活髓系細(xì)胞（Fig4B），并共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和RORγt（Fig4C-D）。此外，Th17.1細(xì)胞通過CCL20-CCR6軸被招募至炎癥部位，其中CCL20由髓系細(xì)胞產(chǎn)生，而CCR6則表達(dá)在T細(xì)胞表面（Fig4B）。免疫熒光蛋白染色進(jìn)一步證實，在肉芽腫內(nèi)部定位的CD3+ T細(xì)胞上表達(dá)CCR6（Fig4E）。
 

Fig 4

5. 結(jié)構(gòu)細(xì)胞促進(jìn)肉芽腫局部炎癥和組織重塑
成纖維細(xì)胞識別出三個群，Cluster 0主要與非病變皮膚相關(guān)，稱為“穩(wěn)態(tài)成纖維細(xì)胞”，cluster1主要由病變皮膚組成，稱為“GA成纖維細(xì)胞”，cluster2則包含來自兩種來源的細(xì)胞混合（Fig5A）。GA成纖維細(xì)胞高表達(dá)促炎基因OSMR及慢性炎癥相關(guān)標(biāo)記FAP、PDPN和THY1，并表現(xiàn)出比穩(wěn)態(tài)成纖維細(xì)胞更高的細(xì)胞異質(zhì)性，主要由于其包含兩個功能不同的亞群；“免疫相互作用成纖維細(xì)胞”高表達(dá)細(xì)胞招募、抗原呈遞和TGF-β信號相關(guān)基因；“組織重塑成纖維細(xì)胞”則高表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分、基質(zhì)調(diào)節(jié)和血管生成相關(guān)基因（Fig5B-C）。GA成纖維細(xì)胞在肉芽腫附近高表達(dá)促炎標(biāo)記物FAP，其中免疫相互作用成纖維細(xì)胞位于肉芽腫周圍，而組織重塑成纖維細(xì)胞主要位于肉芽腫內(nèi)部，提示ECM成分在肉芽腫內(nèi)被分泌（Fig5D）。為識別有助于肉芽腫形成的成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，將GA成纖維細(xì)胞與穩(wěn)態(tài)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了比較，GA成纖維細(xì)胞高表達(dá)免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如IRF8、RELB、STAT2等）以及發(fā)育和IFN反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如HOXC6、IRF5等），這些轉(zhuǎn)錄因子有助于在皮膚肉芽腫中觀察到的天然免疫樣功能和炎癥表型，提示成纖維細(xì)胞在肉芽腫形成中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織重塑作用（Fig5D-E）。
 

Fig 5

6. 提示其在肉芽腫形成中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織重塑作用
為理解細(xì)胞類型在肉芽腫形成中的相互作用，基于配體-受體表達(dá)預(yù)測細(xì)胞間的相互作用分析細(xì)胞間的通信。在肉芽腫內(nèi)，GA輔助性T細(xì)胞通過表達(dá)IFNG作用于巨噬細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞上的IFNGR1，同時表達(dá)LTB與巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的LTBR結(jié)合，促進(jìn)血管生成和ECM重塑（Fig6A）�？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示了肉芽腫內(nèi)部存在多種細(xì)胞間的配體-受體相互作用，包括趨化因子及其受體、細(xì)胞因子及其受體等，如內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的PECAM1（CD31）與肉芽腫內(nèi)GA巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的CD38之間存在相互作用（Fig6B），免疫熒光蛋白染色證實（Fig6C）。此外，成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種整合素（如ITGA4、CD44），與ECM等成分（如FN1、SPP1）結(jié)合，介導(dǎo)免疫細(xì)胞的黏附和遷移（Fig6D）。免疫熒光蛋白染色驗證了整合素與ECM成分（如SPP1-CD44和FN1-α4β1）之間的相互作用，進(jìn)一步支持分子在肉芽腫內(nèi)免疫細(xì)胞遷移和黏附中的作用（Fig6E）。
 

Fig 6

7. 肉芽腫與TLS具有共同的關(guān)鍵特征
本研究揭示了肉芽腫與三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的相似性，TLS在非淋巴組織中形成，有助于有效的免疫反應(yīng)（Fig7A）。通過研究一個包含12種趨化因子的TLS特征，發(fā)現(xiàn)這些趨化因子在肉芽腫中高度表達(dá)（Fig7B-C）。具體來說，CCL5、CXCL9和CXCL10在GA巨噬細(xì)胞中上調(diào)，CCL4和CCL5在GA T細(xì)胞中上調(diào)，而CCL5、CCL19、CXCL9、CXCL10以及CXCL11在GA成纖維細(xì)胞中上調(diào)（Fig7D）。此外，肉芽腫中CCL19-CCR7/CXCR3通路特異性激活，參與T細(xì)胞向淋巴器官的歸巢（Fig7E）。通過使用另外兩個TLS特征進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)肉芽腫與TLS之間高度相似。然而，肉芽腫中的輔助性T細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活，而不是像在癌癥中觀察到的那樣減弱炎癥。因此，肉芽腫形成是一種失調(diào)和異常的淋巴器官形式，利用類似的調(diào)控機制，但未能重現(xiàn)生理正常TLSs的嚴(yán)格控制。最后，使用小鼠肉芽腫形成模型，通過藥物FPA-014靶向基質(zhì)金屬蛋白酶MMP12，發(fā)現(xiàn)用MMP12抑制劑FPA-014治療小鼠4周后，與對照治療相比，肉芽腫誘導(dǎo)的四肢和尾部皮膚腫脹顯著減少（Fig7F）。這些結(jié)果支持基質(zhì)金屬蛋白酶在肉芽腫形成和維持中的功能貢獻(xiàn)，這可能是通過其作為細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)劑和免疫細(xì)胞激活劑的作用介導(dǎo)的。
 

Fig 7

結(jié)語
本研究整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組與免疫染色，系統(tǒng)繪制皮膚結(jié)節(jié)病肉芽腫的細(xì)胞-分子圖譜，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞通過糖酵解-氧化磷酸化重編程及mTOR信號上調(diào)、凋亡下調(diào)維持慢性炎癥；輔助性T細(xì)胞呈現(xiàn)Th17.1表型，分泌IFN-γ、GM-CSF和LTB持續(xù)激活免疫；兩類成纖維細(xì)胞中，免疫相互作用亞群充當(dāng)“非造血免疫細(xì)胞”招募并保留免疫細(xì)胞，組織重塑亞群則與巨噬細(xì)胞協(xié)同驅(qū)動ECM重構(gòu)。肉芽腫在趨化因子譜與空間組織上高度類似三級淋巴結(jié)構(gòu)，卻缺乏自限機制而成為慢性異常淋巴器官�？缙鞴衮炞C顯示關(guān)鍵調(diào)控基因共享，靶向MMP12的小鼠實驗證實可抑制肉芽腫形成。綜上，肉芽腫由免疫代謝重編程、細(xì)胞因子-趨化因子網(wǎng)絡(luò)及ECM-整合素調(diào)控三軸驅(qū)動，為結(jié)節(jié)病等非感染性肉芽腫的精準(zhǔn)干預(yù)提供了分子框架與候選靶點。

參考文獻(xiàn)：
Krausgruber T, Redl A, Barreca D, et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal aberrant lymphoid developmental programs driving granuloma formation. Immunity. 2023 Feb 14;56(2):289-306.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2023.01.014. Epub 2023 Feb 6. PMID: 36750099; PMCID: PMC9942876.