文獻(xiàn)解讀：關(guān)節(jié)炎消退過程中成纖維細(xì)胞的分子重構(gòu)

期刊：Nature Immunology
影響因子：29.6
主要技術(shù)：scRNA-seq、ST

導(dǎo)語
在免疫介導(dǎo)的炎癥性疾�。↖MIDs）中，成纖維細(xì)胞的活化是眾所周知的，成纖維細(xì)胞參與免疫細(xì)胞的募集和活化，并參與組織破壞，從而導(dǎo)致炎癥的慢性化。最近開發(fā)的針對成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）的高度特異性的小分子抑制劑，使得通過正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像在 IMIDs 中檢測人體成纖維細(xì)胞活性成為可能。目前尚不清楚抗炎治療期間成纖維細(xì)胞活化是如何改變的，有證據(jù)表明，盡管炎癥消退，但 IMIDs 中的成纖維細(xì)胞仍保持活化狀態(tài)。在此，作者展示了在關(guān)節(jié)炎消退期間成纖維細(xì)胞被重新編程為抗炎表型，這影響了 FAP 的內(nèi)化，從而影響 PET 成像。在活動性關(guān)節(jié)炎中，檢測到具有高 FAP 內(nèi)化的促炎性 MMP3+/IL6+成纖維細(xì)胞與促炎性免疫細(xì)胞聚集在一起。在消退期間，具有低 FAP 內(nèi)化的 CD200+/DKK3+成纖維細(xì)胞積累，導(dǎo)致 PET 信號降低。它們與諸如 2 型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）等促消退免疫細(xì)胞聚集在一起，并通過 CD200/CD200R1 穩(wěn)定了 ILC2 的表型�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明在關(guān)節(jié)炎消退期間間質(zhì)細(xì)胞區(qū)室存在動態(tài)分子重編程，并揭示了成纖維細(xì)胞此前未被探索的抗炎功能。

關(guān)鍵技術(shù)
scRNA-seq、ST

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. FAP檢測與關(guān)節(jié)炎患者的疾病活動相關(guān)
為了檢測、表征和監(jiān)測關(guān)節(jié)炎中的間充質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，作者開發(fā)了一種在人體內(nèi)測量關(guān)節(jié)中成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）活化的技術(shù)。為此，作者使用特異性結(jié)合活化間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 FAP 的示蹤劑 Ga-FAPI-04 進(jìn)行了正電子發(fā)射斷層掃描/計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET/CT）成像。對 120 名患有炎癥性關(guān)節(jié)疾病的患者（包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎以及無關(guān)節(jié)炎的對照組）進(jìn)行了 FAP-PET/CT 掃描。在關(guān)節(jié)炎患者的滑膜和肌腱附著點(diǎn)處觀察到了間充質(zhì)細(xì)胞活化，表現(xiàn)為局部 FAP 示蹤劑聚集，而非關(guān)節(jié)炎對照組則未見此現(xiàn)象。示蹤劑聚集出現(xiàn)在上肢、下肢和脊柱的關(guān)節(jié)及肌腱附著點(diǎn)。間充質(zhì)細(xì)胞的激活與炎癥跡象相符，這是通過同時進(jìn)行的磁共振成像（MRI）測量得出的，并且與相應(yīng)疾病中經(jīng)過驗(yàn)證的臨床疾病活動綜合評分相關(guān)。為了測試 FAP 信號是否與與結(jié)構(gòu)損傷相關(guān)的成纖維細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)一步根據(jù) MRI 和 CT上是否存在侵蝕和/或骨增生性改變對區(qū)域進(jìn)行分層。在沒有結(jié)構(gòu)變化的炎癥部位，F(xiàn)AP 示蹤劑攝取量低或缺失，而在有侵蝕和骨增生性改變的病變中攝取量高。隨訪掃描顯示，在細(xì)胞因子阻斷后，F(xiàn)AP 信號顯著減少，甚至完全消失。在性別和年齡匹配的對比分析中，IL-17i 治療后 FAP 信號的降低幅度顯著大于 TNFi 治療。這些數(shù)據(jù)表明，在炎癥消退期間，間質(zhì)細(xì)胞的活化是可逆的，提示常駐成纖維細(xì)胞可能改變其功能模式，并可能獲得更具消炎作用的表型。
 

Fig 1. 關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的 FAP 示蹤劑攝取情況

2. 促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)關(guān)節(jié)中成纖維細(xì)胞活化和FAP攝取
為了在功能上測試關(guān)鍵炎性細(xì)胞因子對關(guān)節(jié)中間充質(zhì)活化的作用，在臨床前關(guān)節(jié)炎模型中進(jìn)行了FAP-PET，組織學(xué)分析與炎癥和損傷有關(guān)的變化。未處理小鼠在關(guān)節(jié)中未顯示FAP示蹤劑攝取，并且具有保留的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。FAP示蹤劑的攝取與相應(yīng)踝關(guān)節(jié)的炎癥和損傷程度相關(guān)。與骨增生性病變相比，侵蝕性病變中FAP示蹤劑的攝取沒有差異。TNF和IL-17 α的阻斷顯著降低了關(guān)節(jié)中的FAP示蹤劑攝取，同樣，IL-17 i的效果比TNFi治療更顯著這些數(shù)據(jù)表明人類和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的消退與炎癥消退過程中間充質(zhì)活化的變化有關(guān)。

3. 炎癥消退期間成纖維細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)變
整合了33個scRNA-seq數(shù)據(jù)集得到總共52，131個來自關(guān)節(jié)的間充質(zhì)細(xì)胞，并進(jìn)行了無偏聚類。與以前的報(bào)道一致，綜合數(shù)據(jù)集證實(shí)了關(guān)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞的高度異質(zhì)性。無監(jiān)督聚類顯示了七種不同的間充質(zhì)細(xì)胞類型�；�液襯里和下層襯里亞型之間存在明顯的分離。此外，各自的特征基因與所描述的下層襯里Mmp 3+相關(guān)，I16+、Pi 16+成纖維細(xì)胞亞型，并且還在數(shù)據(jù)集中穩(wěn)健地鑒定了軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。除了成纖維細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的總體中度變化外，在細(xì)胞因子抑制后，檢測到先前未探索的CD200+成纖維細(xì)胞群體的顯著增加。CD200+成纖維細(xì)胞表達(dá)高水平的Cdh 11、Dkk 3，但不表達(dá)Lrrc 15。雖然TNF抑制僅輕微增加CD200+成纖維細(xì)胞，IL-17 a抑制誘導(dǎo)顯著的上調(diào)。為了排除離散聚類引入的潛在偏差及其對細(xì)胞亞型豐度的影響，作者還實(shí)施了MELD算法，MELD證實(shí)，IL-17 i處理后，CD200+成纖維細(xì)胞增加。此外，使用CellRank顯示，在IL-17 i刺激后，所有亞組的亞襯成纖維細(xì)胞中向CD200+成纖維細(xì)胞分化的可能性普遍增加。因此，CD200+成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎消退的時間過程中持續(xù)增加，并最終在完全緩解結(jié)束時減少。
 

Fig 2. Cd200+成纖維細(xì)胞是一種新的成纖維細(xì)胞亞型，在炎癥消退過程中出現(xiàn)

4. CD200+成纖維細(xì)胞維持促消退ILC的2型的命運(yùn)和存活
接下來研究了促分解的CD200+成纖維細(xì)胞的功能特性，對所選通路的單樣本基因集富集分析顯示，與Mmp 3+和Il 6+成纖維細(xì)胞或成骨細(xì)胞相比，CD200+成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制炎癥通路的能。其活化受體CD200R1在ILC 2上顯示出最高表達(dá)，這與關(guān)節(jié)炎的消退有關(guān)。因此，細(xì)胞間相互作用分析揭示了在組織穩(wěn)態(tài)期間CD200+成纖維細(xì)胞和ILC 2之間的穩(wěn)健通信概率，其在關(guān)節(jié)炎期間丟失。為了進(jìn)一步闡明CD200影響ILC 2的機(jī)制，在該模塊中共表達(dá)的基因的功能富集分析表明，CD200R1激活后存在促存活信號因此，CD200R1刺激導(dǎo)致體外ILC 2細(xì)胞凋亡的顯著減少。此外，CD200R1和Gata 3的共表達(dá)表明CD200R1信號傳導(dǎo)在維持ILC 2表型中的潛在作用。通過計(jì)算敲除ILC上的CD200R1來研究這種潛在作用。為了驗(yàn)證這一概念，用重組CD 200-FC治療患有誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的小鼠。這種治療顯著減輕了關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)以及 FAP 示蹤劑的攝取量，并且還顯著減少了關(guān)節(jié)損傷。
 

Fig 3. Cd200+成纖維細(xì)胞維持促消退ILC的2型命運(yùn)和存活

5. 小鼠和人中促消退CD200+ DKK 3+的保守表型
作者探究了這種與 CD200+ 成纖維細(xì)胞相關(guān)的促消退網(wǎng)絡(luò)是否也存在于人類關(guān)節(jié)炎中。在疾病緩解期間，人類關(guān)節(jié)中的 FAP 示蹤劑攝取顯著減少甚至完全消失。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）和銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA）患者滑膜活檢樣本中的 CD200 表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度評分 DAS28 呈負(fù)相關(guān)。通過整合四個公開可用的數(shù)據(jù)集，創(chuàng)建了人類 RA 和 PsA 滑膜單細(xì)胞的綜合圖譜，并確定了主要的細(xì)胞異質(zhì)。接下來，進(jìn)行了進(jìn)一步的整合步驟，將小鼠 Il23mc 處理的 hTNFtg 成纖維細(xì)胞映射到人類對應(yīng)細(xì)胞，從而在人類中識別出與在圖譜上觀察到的相同方式形成不同轉(zhuǎn)錄鄰域的同源成纖維細(xì)胞亞型，同時其marker表達(dá)也相似。為了探究每種成纖維細(xì)胞亞型在組織中的空間分布情況，并量化其與不同免疫細(xì)胞的共定位情況，隨后對RA和PsA患者的滑膜活檢樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。以高分辨率識別組織中的空間異質(zhì)性簇，這些簇對應(yīng)于滑膜組織的致病性和解剖區(qū)域。對與不同細(xì)胞類型相對應(yīng)的基因模塊進(jìn)行評分，然后對這些評分在空間簇之間進(jìn)行層次聚類，揭示了在無明顯炎癥的區(qū)域中，CD200+/DKK3+ 成纖維細(xì)胞與諸如 ILC2s 和嗜酸性粒細(xì)胞等促消退免疫細(xì)胞的共存情況。相比之下，MMP3+ /IL6+ 成纖維細(xì)胞與促炎性免疫細(xì)胞在具有活躍炎癥表型的區(qū)域共定位。此外，對先前在小鼠成纖維細(xì)胞亞型中介紹的通路的評分證實(shí)，在 MMP3+ /IL6+ 集群所在的區(qū)域存在炎癥特征，在 CD200+ /DKK3+ 所在的區(qū)域則存在抗炎特征，這表明成纖維細(xì)胞對炎癥微環(huán)境的調(diào)控具有位置特異性。最后，使用成像質(zhì)譜分析（IMC）來分離 RA 和 PsA 患者滑膜中的 CD200+ 成纖維細(xì)胞。與空間轉(zhuǎn)錄組分析和小鼠數(shù)據(jù)一致，觀察到在關(guān)節(jié)炎緩解的 RA 和 PsA 患者的滑膜中，CD200+ 成纖維細(xì)胞的比例顯著增加。
 

Fig 4. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和成像質(zhì)譜技術(shù)鑒定RA和PsA患者滑膜活檢組織中的C200 + /DKK 3+成纖維細(xì)胞

參考文獻(xiàn)：
Andreas Ramming, Simon Rauber, Hashem Mohammadian et al. Molecular reframing of fibroblasts during resolution of arthritis, 21 March 2023, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2668533/v1]